Визуализация митохондрий в пределах интраэпидермальных нервных волокон

Аннотация

Источник: Hamid, H. S., et al. Трехмерная визуализация и анализ митохондрий в интраэпидермальных нервных волокнах человека. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует метод визуализации нервно-специфических митохондрий с помощью трехмерной визуализации. В нем описан процесс получения последовательных сканов предварительно помеченных внутриэпидермальных нервных волокон и создания 3D-изображений поверхности для выделения и отображения митохондрий по отношению к нервным структурам.

Протокол

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Confocal Imaging

1. Perform confocal imaging:
   1. Собирайте изображения с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа с 40-кратным погружением в масло (1,25 числовой апертуры (N.A.)) объектива на перевернутом микроскопе.
      1. В каждой фокальной плоскости последовательно получать флуоресцентные сигналы:
         Нервные волокна: возбуждение λ= 488 нм, спектральный эмиссионный фильтр λ = 505 - 560 нм
         Митохондрии: возбуждение λ = 543 нм, фильтр спектральной эмиссии λ= 606 - 670 нм
   3. Установите программное обеспечение микроскопа для оптимизированного бокового разрешения (разрешение сканирования = 1,024 x 1,024) и осевого разрешения/оптического сечения (конфокальная апертура = 1 воздушная единица (AU) с размером z-шага 210 нм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результирующее разрешение XYZ составляет 172,2 нм x 172,2 нм x 210 нм с размером изображения 176,1 мкм x 176,1 мкм x 30-50 мкм.
2. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>ПРИМЕЧАНИЕ: Время сканирования с вышеуказанными параметрами занимает примерно 20-40 минут, в зависимости от количества z-слайсов.

2. 3D Визуализация и анализ митохондрий в интраэпидермальных нервных волокнах человека

1. Изолируйте 3D эпидермис:
   1. Дублируйте исходное изображение и используйте проекцию максимальной интенсивности (расширенный фокусный вид) изображения, чтобы идентифицировать и изолировать эпидермис.
   2. Используйте деконволюцию на нервные и митохондриальные флуоресцентные сигналы:
      NOTE:
   3. Вычислите функцию распределения точек (PSF) для зеленого флуоресцентного нервного сигнала (green-fluorescence) со следующими параметрами:
      1. Установите рассчитанный PSF в confocal. Установите показатель преломления среды на 1,515, а числовую апертуру на 1,25. Установите отверстие для обскуры детектора на 1 а.е. Установите длину волны возбуждения лазера на 543 нм и длину волны излучения на 617 нм.
   4. Создание поверхностей, специфичных для нервов:
      1. Используйте инструмент "create surface" для создания твердой поверхности нервов из деконволюционированной зелено-флуоресцентной вторичной маркировки идентифицированных нервов белкового генного продукта 9.5 (PGP9.5).
      2. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости вручную отредактируйте дополнительные ненервные поверхности на вкладке "Edit", удерживая клавишу CONTROL, чтобы выделить несколько объектов, а затем удалить их с помощью клавиши Delete.
   5. Изолировать нервоспецифический флуоресцентный митохондриальный сигнал:
      1. Выберите вкладку "Редактировать" нервной поверхности, чтобы просмотреть функцию "Свойства маски". Созданная нервная поверхность используется для изоляции митохондрий внутри этих нервов вдали от митохондриальных сигналов, связанных с кератиноцитами.
      2. Создание поверхностей, специфичных для митохондрий:
         1. Используйте инструмент "создать поверхность", чтобы создать твердую поверхность митохондрий из вновь созданного флуоресцентного канала нервно-специфических митохондриальных сигналов.
         2. NOTE:

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Leica SP5	Leica Microsystems, Буффало Гроув, Иллинойс	SP5
Volocity x64 software	Perkin Elmer, Waltham, MA	Version 4.4.0<
Imaris x64 3D Analysis software	Bitplane, Concord, MA	Version 7.7.1	Программное обеспечение Imaris используется для анализа изображений

td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Программное обеспечение Volocity используется для обработки изображений