Визуализация кальция ex vivo для изучения реакции мозга дрозофил на нейропептиды

Аннотация

Источник: Ишимото, Х. et. al., Визуализация кальция ex vivo для визуализации реакции мозга на эндокринную сигнализацию у дрозофил. J. Vis. exp.} (2018)

Это видео демонстрирует визуализацию кальция для изученияДрозофила реакция мозга на нейропептиды. Нейроны, экспрессирующие флуоресцентный индикатор кальция, выявляют внутриклеточную динамику кальция и функциональные реакции на сигнальные молекулы.

Протокол

1. Приготовление эксплантов мозга личинок

1. Сделайте камеру для визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильная запись требует, чтобы мозговые экспланты были привязаны. Здесь недорогая камера для визуализации ручной работы используется в системе визуализации Ca²⁺.
   1. С помощью щипцов поцарапать нижнюю часть пластиковой чашки для культивирования (35 мм x 10 мм), чтобы создать вмятину для вентрального ганглия мозга личинки, облегчая монтаж (шаг 1.3, Рисунок 1).
   2. С помощью зубочистки нанесите небольшую каплю суперклея по обе стороны от вмятины и прикрепите к клею вольфрамовый стержень (диаметр 0,125 мм, длина от 6 до 7 мм).
   3. Используя небольшой кусочек многоразового клея, похожего на шпаклевку, сделайте круглую стенку (10 мм в диаметре и 3 мм в высоту) вокруг вмятины (}Рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пространство внутри стены позже будет заполнено фосфатно-солевым буфером (PBS; 0,14 М хлорида натрия ( NaCl), 0,0027 М хлорида калия (KCl), 0,01 М фосфат-иона (PO4{{}}^3–), pH 7,4 ± 0,05 при 25 °C).
2. Животный препарат
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации кальция индикатор кальция, GCaMP6s, экспрессируется в интересующем типе клеток, что обычно достигается с использованием комбинаций тканеспецифичных GAL4 и UAS-GCaMP6s. Чтобы гарантировать, что сигнал опосредован рецептором-кандидатом, GCaMP6s также экспрессируется в мутантном дефекте рецептора.
   1. Когда требуется экспериментальное сравнение для различных генотипов, таких как дикий тип и мутанты, личинки теста соответствуют возрасту, чтобы избежать вариаций уровня экспрессии GCaMP6 и физиологических различий из-за стадий развития.
   2. Храните родительских мух (по 30 мух каждого пола) в флаконе для культивирования, содержащем стандартный корм для мух, в течение 8 часов, чтобы дать возможность отложить яйца на поверхности корма. Культивируют личинки в массе при 12-часовом цикле свет-темнота при 25 °С и относительной влажности воздуха 60-70%.

3. Вскрытие мозга личинки
   1. Через 90-120 ч после кладки яиц (AEL) соберите личинки и промойте их не менее 3 раз дистиллированной водой, чтобы удалить прилипшие остатки пищи.
   2. Поместите личинку на квадратное 1,5-дюймовое стекло для часов, наполненное ледяным PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ:} Следующие два шага выполняются в этом часовом стекле под препарирующим микроскопом.
   3. С помощью щипцов аккуратно захватите среднюю часть личинки. С помощью других щипцов возьмитесь за крючки для рта и осторожно потяните за крючки для рта, чтобы отделить переднюю часть личинки, содержащую мозг, от остальной части тела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать хирургические ножницы.
   4. Возьмите передний кончик щипцами и выверните личинку наизнанку. Удалите посторонние ткани, прикрепленные к мозгу, такие как имагинальные диски, жировые тела и кольцевые железы. Аккуратно отделите мозг от ротовых органов.
   5. Нанесите 200 мкл PBS на внутреннюю часть кольца, изготовленного из многоразового клея, похожего на шпатлевку, в камере визуализации. Аккуратно отсосите рассеченный мозг с помощью PBS в пастеровскую пипетку, а затем перенесите его в камеру визуализации.

4. Установка мозга в камеру визуализации
   1. Используйте щипцы для захвата мышечных волокон, отходящих от вентральных ганглиев. Аккуратно вставьте мозг во вмятину под вольфрамовой проволокой.
   2. С помощью другого щипца слегка потяните вольфрамовую проволоку вверх, чтобы поместить мозг в правильное положение для визуализации (Рисунок 1).

2. Получение Ca²⁺

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспланты мозга, погруженные в PBS, визуализируются с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного 20-кратной линзой водно-иммерсионного объектива (числовая апертура, N.A. = 0,5). PBS не активирует клетки мозга. Если требуется получение изображений по оси Z, объектив устанавливается с помощью пьезоэлектрически активируемого движителя объектива. Вращающаяся дисковая конфокальная головка используется для улучшения временного разрешения. Для получения изображений при слабом освещении на микроскоп устанавливается камера устройства с зарядовой связью, умножающая электроны. Для визуализации флуоресценции GCaMP6s (возбуждение/излучение: 488/509 нм) для возбуждения требуется лазер с длиной волны 488 нм с дихроичным светоделителем и эмиссионным фильтром (e.g., 528 ± полосовым фильтром 38 нм).

1. Поместите камеру визуализации, содержащую эксплант мозга, под микроскоп.
2. Опустите линзу объектива до тех пор, пока она не коснется PBS. При яркопольном освещении расположите мозг и сфокусируйте его. Переключитесь на флуоресцентный свет и отрегулируйте фокус на ячейках, помеченных GCaMP6s.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Базальная зеленая флуоресценция GCaMP6 должна быть видна.
3. Начните сбор данных со скоростью 250 мс/кадр с разрешением 512 × 512 пикселей в режиме водяного охлаждения с использованием соответствующего программного обеспечения для сбора данных (e.g., μManager). Отрегулируйте время экспозиции для получения значений флуоресценции в динамическом диапазоне камеры устройства с зарядовой связью (ПЗС), но не ниже 1000 (условных единиц), при 16-битных изображениях (динамический диапазон 0-65,535).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует использовать низкое время экспозиции, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание GCaMP6. Время экспозиции должно быть оптимизировано в каждом эксперименте, так как оно зависит от уровней экспрессии GCaMP6 и чувствительности системы детектирования. Это было 100 мс в нашем эксперименте с использованием dilp2>GCaMP6s. Когда для заданной глубины изображения требуются z-срезы, можно получить несколько изображений z-сечения в зависимости от времени экспозиции и интервалов кадров. Если камера имеет достаточное пространственное разрешение, то для уменьшения времени экспозиции следует увеличить размер биннинга (количество регистров на чипе, которые будут объединены в один цифровой пиксель).
4. После определения параметров визуализации сделайте снимки за 1 минуту до введения пептида, чтобы определить интенсивность исходного сигнала (F₀).
5. Нанесите тестируемый пептид; Для этого растворите 100 мкл раствора пептида в PBS и пипеткой поместите его непосредственно в ванну с личинками для получения оптимальной концентрации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор пептида следует вводить медленно (e., скорость потока 20 мкл/с) в раствор для ванны с помощью пипетки. В качестве отрицательного контроля используется неродственный синтетический пептид, растворенный в PBS.
6. Запишите излучение GCaMP6s в течение нескольких минут.

Результаты

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Вольфрамовый стержень	A-M systems, Sequim, WA, США	717000
Blu Tack	Bostik, Париж, Франция	3049100	Многоразовые клеи<
Часы стекла, квадратные, 1 5/8 дюйма	Carolina Biological Supply Company, Берлингтон, Северная Каролина, США	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Кусацу, Сига, Япония	T900	Фосфатированные буферные соли
CCHa2	SCRUM Inc., Токио, Япония		Синтезированный Custum-синтезированный пептид
Ghrerin	Peptide Institute Inc., Осака, Япония	4372-s	<
Nociceptin	Peptide Institute Inc., Осака, Япония	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Германия	Axio Imager A2	Fluorescence microscope
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Германия	420957-9900-000	Объектив с погружением в воду
P-725 Сканер объектива PIFOC с большим диапазоном хода	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Карлсруэ, Германия	N/A	Пьезоэлектрически активируемый двигатель линз
Confocal scanner unit CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Токио, Япония	CSU-W1	Вращающийся диск конфокальная головка
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Сидзуока, Япония	C9100-13	EM-CCD camera
OBIS 488 nm LS 60 mW<	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Рочестер, Нью-Йорк, США	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	Dichroic beam splitter
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Рочестер, Нью-Йорк, США	FF01-528/38-25	Emission filter
μManager	Открытая визуализация, Инк.	N/A	https://micro-manager.org

tr style='height:20px;'>tr style='height:20px;' >td style='background-color:#ffffff; цвет:#1a202c; семейство шрифтов:Arial; размер шрифта: 10pt; font-weight:normal; overflow:hidden; отступ: 0 пикселей 3 пикселя; text-align:center; vertical-align:bottom; пробел-спейс:нормальный; word-wrap:break-word; wrap-strategy:4; ' >Coherent, Санта-Клара, Калифорния, США