Визуализация нейрональных митохондрий с помощью серийного сканирующего электронного микроскопа

Аннотация

Источник: Mukherjee, K., et. al. Анализ митохондрий мозга с использованием серийной сканирующей электронной микроскопии. J. Vis. exp.{{}}

} Это видео демонстрирует подготовку, визуализация и анализ тканей мозга мыши с использованием серийного сканирующего электронного микроскопа (SBFSEM) для визуализации ультраструктуры митохондрий, что позволяет точно картировать их морфологию и пространственное распределение в аксональных и дендритных нейронных компартментах.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и утверждены соответствующими Комитет по этической экспертизе животных.

1. Подготовка мозговой ткани и визуализация SBFSEM

1. Обезболите молодую (~2 - 4 месяца) черную мышь C57 (штамм C57BL/6J) с использованием 4-5% изофлурана в соответствии с рекомендациями учреждения. Подтвердите обезболивание, отслеживая потерю мышечного тонуса, отсутствие произвольных движений и реакцию на аверсивные стимулы, такие как щипывание хвоста.
2. Note:Note:^oC.
3. Note: .
4. Note:₂O (dH₂O). Держите раствор ферроцианида калия на льду. Непосредственно перед использованием добавьте 10 мл 4% тетраоксида осмия (OsO4).
5. ₂O.
6. ₂₂O.
7. ₄ до 2% с dH_2<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>O, и окрашивать ткани 2% водным тетраоксидом осмия путем инкубации в течение 1 часа. Стирка ткани 3 раза, по 5 минут каждая, с dH₂O.
8. ₂O при 4 °C.
10. Растворите 0,998 г L-аспартата в 250 мл dH₂O, а затем добавить 10 N гидроксида калия (KOH) по каплям, пока pH не достигнет 5,5. После коррекции pH добавьте 0,066 г нитрата свинца в 10 мл аспарагиновой кислоты и нагревайте до 60 °C в течение 30 минут.

₂₂O.

Note:Note:Note: Note:2. Анализ набора данных изображений

Примечание: Программное обеспечение Image J/Fiji используется для анализа набора данных и полагается на плагин TrakEM2. Этапы предварительной обработки могут выполняться с использованием различного программного обеспечения и могут быть обширными или незначительными в зависимости от уровня опыта и полученных стеков. Здесь описаны основные преобразования с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом (ImageJ ver 1.50b, FIJI download 1 Oct 1, 2015).

1. Конвертируйте изображения в 8-битный формат tiff из оригинальных проприетарных 16-битных изображений, открыв программу и выбрав пункты меню Image→Type→8 bit.
   1. Если автоматическое преобразование контрастности/яркости на этом шаге не идеально для изображений, снова откройте 16-битные изображения и нажмите Image→Adjust→Brightness/Contrast. Выберите диапазон, который подходит для всех изображений, и нажмите Применить. Затем выполните преобразование. Note: На некоторых SEM для этого шага может потребоваться микроскоп производителя программного обеспечения.
   2. e.gNote:
   3. Если требуется, увеличьте размер холста перед регистрацией (Image→Adjust→CanvasSize) или уменьшите его до области интереса (Image→Crop).
      Note:e.g. ImageJ/FIJI, Плагины→Регистрация→ManualLandmarkSelection).
2. e.g<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal; font-weight:400; text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>. 25%) с помощью ImageJ (Image→Scale).

Материалы