Визуализация нейрональных митохондрий с помощью серийного сканирующего электронного микроскопа

Аннотация

Источник: Mukherjee, K., et. al. Анализ митохондрий мозга с использованием серийной сканирующей электронной микроскопии. J. Vis. exp.{{}}

} Это видео демонстрирует подготовку, визуализация и анализ тканей мозга мыши с использованием серийного сканирующего электронного микроскопа (SBFSEM) для визуализации ультраструктуры митохондрий, что позволяет точно картировать их морфологию и пространственное распределение в аксональных и дендритных нейронных компартментах.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и утверждены соответствующими Комитет по этической экспертизе животных.

1. Подготовка мозговой ткани и визуализация SBFSEM

1. Обезболите молодую (~2 - 4 месяца) черную мышь C57 (штамм C57BL/6J) с использованием 4-5% изофлурана в соответствии с рекомендациями учреждения. Подтвердите обезболивание, отслеживая потерю мышечного тонуса, отсутствие произвольных движений и реакцию на аверсивные стимулы, такие как щипывание хвоста.
2. Note:Note:^oC.
3. Note: .
4. Note:₂O (dH₂O). Держите раствор ферроцианида калия на льду. Непосредственно перед использованием добавьте 10 мл 4% тетраоксида осмия (OsO4).
5. ₂O.
6. ₂₂O.
7. ₄ до 2% с dH_2<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>O, и окрашивать ткани 2% водным тетраоксидом осмия путем инкубации в течение 1 часа. Стирка ткани 3 раза, по 5 минут каждая, с dH₂O.
8. ₂O при 4 °C.
10. Растворите 0,998 г L-аспартата в 250 мл dH₂O, а затем добавить 10 N гидроксида калия (KOH) по каплям, пока pH не достигнет 5,5. После коррекции pH добавьте 0,066 г нитрата свинца в 10 мл аспарагиновой кислоты и нагревайте до 60 °C в течение 30 минут.

₂₂O.

Note:Note:Note: Note:2. Анализ набора данных изображений

Примечание: Программное обеспечение Image J/Fiji используется для анализа набора данных и полагается на плагин TrakEM2. Этапы предварительной обработки могут выполняться с использованием различного программного обеспечения и могут быть обширными или незначительными в зависимости от уровня опыта и полученных стеков. Здесь описаны основные преобразования с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом (ImageJ ver 1.50b, FIJI download 1 Oct 1, 2015).

1. Конвертируйте изображения в 8-битный формат tiff из оригинальных проприетарных 16-битных изображений, открыв программу и выбрав пункты меню Image→Type→8 bit.
   1. Если автоматическое преобразование контрастности/яркости на этом шаге не идеально для изображений, снова откройте 16-битные изображения и нажмите Image→Adjust→Brightness/Contrast. Выберите диапазон, который подходит для всех изображений, и нажмите Применить. Затем выполните преобразование. Note: На некоторых SEM для этого шага может потребоваться микроскоп производителя программного обеспечения.
   2. e.gNote:
   3. Если требуется, увеличьте размер холста перед регистрацией (Image→Adjust→CanvasSize) или уменьшите его до области интереса (Image→Crop).
      Note:e.g. ImageJ/FIJI, Плагины→Регистрация→ManualLandmarkSelection).
2. e.g<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal; font-weight:400; text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'>. 25%) с помощью ImageJ (Image→Scale).

Материалы

http://rsb.info.nih.gov/ij/http://fiji.sc/TrakEM2

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
C57BL/6J mice<	664
Isoflurane	VETone, торговое название Fluriso	501017
Dissection tray	Fisher scientific	S65105	<
Ножницы для рассечения	Ted Pella Inc.	1316	<
Butterfly canula<	26704
Фосфатный буфер физиологического раствора	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Filter (0.45 микрона)	EMD Millipore	NC0813356
Микроскоп для вскрытия	Olympus	SZ61
система секционирования вибратома	Ted Pella Inc.	Vibratome 3000
Sodium Cacodylate	EMS	12300
Tannew Acid	EMS	21700
Ферроцианид калия	J.T. Baker	14459-95-1	<
Раствор тетраоксида осмия 4%	EMS	19150
Thiocarbohydrazide	EMS	21900
L-Aspartic Acid<	A93100
Гидроксид калия	Acros Organics	43731000	<
Свинцовая селитра	EMS	17900
EMbed-812 НАБОР ВСТРАИВАНИЯ	EMS	14120	Содержит смолу Embed 812, DDSA, NMA и DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade	Polysciences Inc.	1909
Paraformaldehyde<	19202
Uranyl Acetate	EMS	22400
Ethanol	EMS	15055
Propylene Oxide	EMS	20400
Embedding Mold	EMS	70907	<
Алюминиевый образец булавки	EMS	70446
Коллоидная серебряная жидкость	EMS	12630
Razor<	72000
Super Glue (контроль Loctite Gel)	Loctite	234790
Проводящая эпоксидная смола	Ted Pella Inc.	16043	<
Сканирующий электронный микроскоп	Zeiss	Sigma VP
In camera ultramicrotome for SEM	Гатан Инк.	3View2	Может быть разработан для других SEM
Микроскоп для подготовки к булавке	Гатан Инк.	поставляется как часть системы 3View
Детектор обратного рассеяния электронов с низким кВ<	3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package	ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015		http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
	<
<	http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
	<

td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Jackson laboratorytr style='height:20px;' >tr style='height:20px;' >td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Exel Internationaltr style='height:20px;'>td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal; overflow:hidden; padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Sigma-Aldrichtr style='height:20px;'>td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden; padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>EMStr style='height:21px;' >td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden; padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>EMStr style='height:21px;' >td style='background-color:#ffffff; цвет:#1a202c; font-family:Roboto; размер шрифта: 7pt; font-weight:normal; overflow:hidden; отступ: 0 пикселей 3 пикселя; vertical-align:bottom; пробел-спейс:нормальный; word-wrap:break-word; wrap-strategy:4; ' >Гатан Инк.td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> <td style='background-color:#ffffff; цвет:#1a202c; font-family:Roboto; размер шрифта: 7pt; font-weight:normal; overflow:hidden; отступ: 0 пикселей 3 пикселя; vertical-align:bottom; пробел-спейс:нормальный; word-wrap:break-word; wrap-strategy:4; ' >td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> <td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>td style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> <td style='color:#0563c1; font-family:Roboto; размер шрифта: 7pt; font-weight:normal; overflow:hidden; отступ: 0 пикселей 3 пикселя; vertical-align:bottom; пробел-спейс:нормальный; word-wrap:break-word; wrap-strategy:4; ' >