Методическая статья

Идентификация подтипов ганглиозных клеток сетчатки мыши с помощью флуоресцентной трассировки

29 мая 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Laboissonniere, et. al. РНК-секвенирование одиночных клеток определенных подмножеств ганглиозных клеток сетчатки. J. Vis. exp. (2017).

Это видео демонстрирует метод флуоресцентной трассировки для определения подтипов ганглиозных клеток сетчатки (РГК) в трансгенной сетчатке мыши. Процесс включает в себя закрепление изолированной сетчатки в записывающей камере, поддержание жизнеспособности клеток с помощью оксигенированной перфузии и нацеливание на флуоресцентно меченные РГК с помощью пипетки с индикатором. Анализируя морфологию и стратификацию дендритов, метод позволяет классифицировать различные подтипы RGC.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

<

p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:' dir='ltr'>Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующей экспертизой по этике животных.

1. Подготовка ткани сетчатки (2 часа)

NOTE:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none; vertical-align:baseline; white-space:pre-wrap;'> Все процедуры в этом разделе должны выполняться при тусклом красном освещении

  1. Животные адаптируются к темноте как минимум за 1 час до вскрытия. Выполняйте все процедуры при тусклом красном освещении.
  2. 2
  3. Промойте кусочек сетчатки в кислородонасыщенном внеклеточном растворе и поместите ткань в камеру для записи со стеклянным дном; используйте пластиковую пипетку для переноса с отрезанным кончиком, чтобы позволить перенести сетчатку без повреждения ткани.
  • NOTE:3. Визуализация и нацеливание GFP+ на ганглиозные клетки сетчатки (10 мин)

    NOTE:

  • Прежде чем начать, вытяните стеклянные микропипетки (внешний диаметр [OD]: 1,2 мм, внутренний диаметр [ID]: 0,69 мм) для электрофизиологических записей с помощью съемника микропипетки. Используйте следующий протокол для электродов (обратите внимание, что параметры должны быть отрегулированы соответствующим образом для достижения желаемого сопротивления и будут варьироваться в зависимости от съемников и с разным стеклом): Нагрев: Рампа +10; Тяга: 0; Вел: 23; Задержка: 1; Давление: 500; Цикл программы: 5 раз. Убедитесь, что диаметр наконечников составляет ~1 мкм, а сопротивление составляет 2-4 МОм для больших ячеек и 5-7 МОм для более мелких клеток.
  • Рисунок 1AРисунок 1B).
  • e.g.,NOTE:Figure 1Cin vitro

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    figure-results-1

    Рисунок 1: Идентификация типо...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Diethyl pyrocarbonate (DEPC)Sigma AldrichD5758 <
    Alexa Fluor 594 HydrazideInvitrogenA10442
    чашка Петри (диаметр 35 мм)Thermo Fisher Scientific153066 <
    Офтальмологические ножницыИнструменты Fine Science15000-00 <
    #5 ЩипцыFine Science Tools11252-30
    Glass MicropipetteSutterBF120-69-10 <
    Micropipette PullerSutter <
    1mL шприцFisher Scientific14-823-2F
    tr style='height:20px;'>tr style='height:20px;'>tr style='height:20px;'>tr style='height:20px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>P-1000 горизонтальный вытягиватель пипетки

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    GFP

    Похожие статьи