Флуоресцентная фотоактивационная визуализация транспорта нейрофиламентов в миелинизированных аксонах мышей

Аннотация

Источник: Бойер, Н. П. et. al., Визуализация и анализ транспорта нейрофиламентов в иссеченном большеберцовом нерве мыши. J. Vis. Exp. (2020)

}Это видео демонстрирует метод флуоресцентной фотоактивации для анализа Транспорт нейрофиламентов в миелинизированных аксонах периферических нервов. Отслеживая фотоактивированные зеленые нейрофиламенты, помеченные флуорофорами, этот метод дает представление о транспорте аксонов при нейродегенеративных заболеваниях.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Приготовление раствора нервно-физиологического раствора

1. Приготовьте 100 мл физиологического раствора Брейера: 98 мМ хлорида натрия (NaCl), 1 мМ хлорида калия (KCl), 2 мМ дигидрофосфата калия (KH₂PO₄), 1 мМ сульфата магния (MgSO₄), 1,5 мМ хлорида кальция (CaCl₂{{}}}), 5,6% D-глюкозы, 23,8 мМ бикарбоната натрия (NaHCO₃}) в воде двойной дистилляции.
2. Процедите 95% кислорода/5% углекислого газа (карбогена) через солевой раствор не менее чем за 30 минут до использования. Оставшийся физиологический раствор можно использовать повторно в течение одной недели; Однако перед каждым использованием его необходимо повторно насыщать кислородом.
3. Налейте насыщенный кислородом физиологический раствор в шприц объемом 60 мл и убедитесь, что в шприце остается минимальное количество воздуха.

2. Первоначальная сборка камеры перфузии нерва

1. Соедините шприц и трубку, как показано на рисунке Рисунок 1A), поместив отводящую трубку в колбу для отходов.
2. Поместите внешнюю прокладку в корпус перфузионной камеры, убедившись, что входные и выпускные штифты потока совпадают с отверстиями в прокладке.
3. Положите внутреннюю прокладку (силикон толщиной 100 мкм) на круглое покровное стекло #1.5 (диаметр 40 мм), тщательно разглаживая складки на прокладке, чтобы обеспечить плотное прилегание. Чтобы облегчить последующую сборку, поместите защитный колпачок и прокладку на бумажное полотенце или протирку прокладкой вверх.

3. Рассечение и препарирование большеберцового нерва мыши

1. Принесите животное в жертву путем ингаляции углекислым газом или другим методом, одобренным учреждением. Запускайте таймер, когда животное перестает двигаться/дышать, так как эксперименты должны проводиться только в течение 3 часов после жертвоприношения.
2. Сбрызните шерсть 70% этанолом и удалите как можно больше с ног и спины животного с помощью электрической бритвы.
3. С помощью больших ножниц для вскрытия сделайте дорсальный разрез на коже в районе середины позвоночника и продолжайте разрез вокруг вентральной стороны животного. Начиная с этого разреза, медленно отражайте кожу от ног, аккуратно оттягивая ее от мышцы и разрезая фасцию.
4. Поместите животное в лежачем положении на спине на поддон для вскрытия и приколите все четыре лапы. По желанию приколите хвост, чтобы еще больше уменьшить движение.
5. С помощью ножниц для микродиссекции сделайте разрез в мышцах бедра посередине между хвостом и коленом, чтобы обнажить седалищный нерв. Следите за тем, чтобы нерв, который виден через мышцу, не был перерезан.
6. Расширьте разрез дорсально и вентрально, чтобы удалить мышцу. Точно так же удалите мышцы икры, делая разрезы неглубокими и короткими, чтобы не повредить нервы.
7. Удаляйте мышцы до тех пор, пока большеберцовый нерв не будет полностью обнажен от точки, где он ответвляется от седалищного нерва (в колене) до пятки (Рисунок 2A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На всех этапах, включая и после рассечения большеберцового нерва, избегайте ненужного воздействия окружающего света, чтобы свести к минимуму возможную случайную активацию фотоактивируемого зеленого флуоресцентного белка (paGFP) в нерве.
8. Захватите большеберцовый нерв на проксимальном конце позвоночника с помощью щипцов и разрежьте нерв с помощью ножниц для микродиссекции. Стараясь не напрягать нерв, приподнимайте его в сторону от мышцы, отсекая любые прикрепления.
9. Разрежьте дистальный конец большеберцового нерва и переложите в маленькую чашку Петри с кислородным раствором комнатной температуры. С этого момента процедуры всегда следите за проксимальными и дистальными концами нерва.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один из способов сделать это - отметить дистальный конец нерва угловым разрезом так, чтобы конусность была видна.
10. Начиная с проксимального конца нерва, аккуратно обхватите открытые концы аксона парой щипцов с очень тонкими наконечниками.
11. С помощью второй пары щипцов обхватите нервную оболочку проксимально и медленно потяните к дистальному концу нерва. Нервная оболочка будет скользить по аксонам с минимальным сопротивлением. Следите за тем, чтобы во время этого процесса нерв не подвергался чрезмерному напряжению.

4. Окончательная сборка перфузионной камеры нерва

1. Захватив проксимальный конец нерва, извлеките его из физиологического раствора и медленно положите на покровную крышку перфузионной камеры в прямоугольном отверстии внутренней прокладки, поддерживая легкое натяжение нерва, когда вы кладете его так, чтобы он лежал прямо.
2. Поместите предметное стекло микроводопровода на нерв бороздчатой стороной к нерву и направлением потока параллельно нерву. Переверните крышку и узел микроакведука и поместите его в корпус перфузионной камеры так, чтобы ползунок микроакведука был прилегает к внешней прокладке. Нерв и окружающая его внутренняя прокладка теперь будут зажаты между покровным стеклом и предметным стеклом микроакведука, которые отделены прокладкой, обращенным покровным стеклом вверх (Рисунок 1B).
3. Закрепите перфузионную камеру, поместив ее в металлический корпус и вращая стопорное кольцо. Убедитесь, что пластиковый корпус полностью проходит под всеми металлическими зажимами, и хорошо затяните, чтобы предотвратить утечку физиологического раствора. Чрезмерная затяжка может привести к появлению трещин на предметном стеколе микроакведука или покровном стекле. Переверните камеру так, чтобы покровная крышка была обращена вниз.
4. Медленно нажмите на поршень шприца с физиологическим раствором, чтобы заполнить камеру перфузии. Во время настройки и визуализации впускная и выпускная трубки, выпускная колба и шприц всегда должны находиться над самой камерой. Это позволяет избежать сифонирования, которое может привести к образованию пузырьков или вызвать нестабильность фокусировки из-за отрицательного давления в камере.
5. Перенесите перфузионный узел на перевернутый предметный столик микроскопа и установите шприц с физиологическим раствором в шприцевой насос. Запустите двигатель с соответствующей скоростью для расхода 0,25 мл/мин. Затем подключите и включите встроенный нагреватель раствора, установленный на 37 °C.
6. Подключите нагреватель объектива и установите его на 37 °C, нанесите масло на объектив и вставьте перфузионную камеру в крепление для сцены.
7. Нанесите масло на нагревательную прокладку камеры и присоедините к перфузионной камере. Подключите и включите камерный нагреватель; установить на 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения температуры могут привести к образованию пузырьков в камере перфузии из-за дегазации раствора. Если образуются пузырьки, кратковременно увеличьте скорость потока раствора в 5-10 раз, пока пузырьки не выйдут из камеры.
8. Зафиксируйте перфузионную камеру в адаптере предметного стекла и приведите масло объектива в контакт с покровным стеклом на нижней стороне камеры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая здесь камера Bioptechs с адаптером столика ASI предназначена для конфигурации инвертированного микроскопа.

5. Флуоресцентная активация и получение изображения

1. Используя светлопольное освещение, сфокусируйтесь на слое аксонов на нижней поверхности нерва, ближайшей к поверхности покровного стекла (Рисунок 2B). Миелинизированные аксоны (обычно 1 - 6 мкм в диаметре у взрослых мышей) могут быть идентифицированы по наличию миелиновой оболочки, которая видна при освещении в ярком поле проходящим светом без усиления контраста. Также легко заметны расщелины Шмидта-Лантермана и узлы Ранвье. Немиелинизированные аксоны более тонкие (обычно <1 мкм в диаметре) и обычно присутствуют в пучках (пучках Ремака), где они, как правило, расположены слишком близко, чтобы их можно было отделить друг от друга.
2. Если она имеется на микроскопе, активируйте систему автофокусировки, чтобы сохранить фокус в течение всего периода цейтраферной съемки.
3. Получите эталонное изображение в светлом поле. Запишите ориентацию нерва (позвоночник-проксимальный и дистальный концы) по отношению к изображениям.
4. Получите конфокальное изображение с помощью лазера с длиной волны 488 нм и эмиссионного фильтра, подходящего для paGFP (например, 525/50 нм), чтобы зарегистрировать автофлуоресценцию перед отбеливанием. Держите мощность лазера на низком уровне, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание, при этом время экспозиции должно быть отрегулировано соответствующим образом, чтобы обнаружить слабый сигнал. В качестве примера были получены репрезентативные данные при мощности лазера 5% и экспозиции 4 с. Запишите настройки сбора данных для использования во всех будущих экспериментах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После фотоактивации, идеальные настройки изображения дадут соотношение сигнал/шум > 8 и фотообесцвечивание менее 25% от исходного сигнала в течение 20 изображений. Аксоны также могут быть визуализированы с помощью широкопольной эпифлуоресцентной микроскопии, как мы это делали изначально, но качество изображения будет хуже из-за отсутствия конфокальности.
5. Установите мощность лазера примерно в 5 раз больше нормальной мощности изображения и получите изображение со временем экспозиции 3-4 минуты. Хотя этот шаг не является обязательным, рекомендуется для отбеливания автофлуоресценции и других источников нежелательной флуоресценции, чтобы уменьшить фоновый сигнал и, таким образом, максимизировать соотношение сигнал/шум фотоактивированной флуоресценции.
6. Получите изображение с настройками, использованными на шаге 5.4, чтобы записать автофлуоресценцию перед активацией после этого этапа обесцвечивания.
7. На светлопольном изображении проведите линию, параллельную аксонам, длину которой равна желаемому размеру окна активации. Длина этого окна будет варьироваться в зависимости от цели эксперимента и параметров, но типичные длины составляют 5 мкм для парадигмы убегания импульса и 40 мкм для парадигмы с рассеиванием импульса.
8. Используя эту линию в качестве ориентира, нарисуйте прямоугольную область интереса (ROI) поперек поля зрения перпендикулярно аксонам. Эта область должна охватывать все аксоны, которые должны быть фотоактивированы.
9. Определите оптимальные настройки для фотоактивации при освещенности 405 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте только этот шаг и подшаги до первой экспериментальной активации. В ходе эксперимента необходимо использовать одни и те же настройки фотоактивации.
   1. Активируйте интересующую область многократно с помощью лазерной линии с длиной волны 405 нм, низкой мощности лазера (например, 5%) и времени задержки пикселей (например, 40 μс) и одного импульса, получая изображение активированного зеленого флуоресцентного белка или флуоресценции GFP после каждой активации. Повторяйте до тех пор, пока флуоресценция не перестанет увеличиваться, а затем количественно оцените флуоресценцию в интересующей области для каждого изображения.
   2. Построение графика зависимости средней интенсивности флуоресценции от числа импульсов. Выберите количество импульсов, после которых флуоресценция больше не увеличивается, в качестве оптимального количества импульсов для активации.
10. Активируйте флуоресценцию paGFP в области, нарисованной на шаге 5.8, путем структурированного возбуждения светом с длиной волны 405 нм. Убедитесь, что изображение получено непосредственно до и сразу после активации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальная активация paGFP создаст четко определенную область флуоресценции с четкими границами, содержащимися в области интереса или ROI.
11. Запустите таймер на 1 минуту после завершения активации. По истечении 1 минуты начните съемку таймлапс-серии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Задержка в 1 минуту необходима для того, чтобы учесть увеличение флуоресценции, которое наблюдается после фотоактивации paGFP. Для метода импульсного разброса достаточно 5-10-минутного периода регистрации с 30-секундными интервалами для измерения начальных наклонов в центральном и фланкирующем окнах для измерения скорости и направленности. Для метода управления импульсом период регистрации составляет 30-150 минут с 5 или 10-минутными интервалами таймлапса, что позволяет проанализировать поведение нитей при длительной паузе.
12. Сохраните все полученные изображения, а также ROI, использованный для активации флуоресценции.
13. Перейдите на новую область нерва и повторите шаги 5.1-5.11. Если новая область находится вдоль того же аксона, она должна находиться на расстоянии не менее 500 мкм от ранее активированной области, чтобы избежать обнаружения флуоресцентных нейрофиламентов, которые вышли из другой активированной области. Получение финального таймлапса должно завершиться до окончания 3-часового окна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что препарат может быть жизнеспособным дольше 3 часов, но мы это не подтвердили. При умелом препарировании и подготовке в течение этого 3-часового окна можно получить от пяти до восьми 10-минутных наборов снимков.
14. После получения окончательного таймлапс-изображения следует остановить подачу физиологического раствора, отсоединить нагреватели раствора и камеры, а также снять перфузионный аппарат со предметного столика микроскопа.

Результаты

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
14 x 22 Прямоугольная прокладка 0,1 мм	Bioptechs	1907-1422-100	Внутренняя прокладка
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm Круглая прокладка с отверстиями	Bioptechs	1907-08-750	Outer gasket
35 x 10 мм тарелка	Thermo Fisher	153066	Dissection dish
40 мм круглые обложки	Bioptechs	40-1313-0319
60mL шприц - наконечник Luer-lock	BD	309653
Andor Revolution WD с конфокальной системой с вращающимся диском	Andor		Оснащен системами Perfect Focus и FRAPPA
Calcium chloride	Fisher	C79	<
Coverslips	Fisher	12-541-B	Для слайда с флуоресцеином
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Разбор булавок	Инструменты для тонкой науки	26001-70
Щипцы для рассечения	Инструменты для тонкой науки	11251-30	Щипцы с тонкими наконечниками
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Кастрюля для вскрытия с воском	Ginsberg Scientific	568859
Ножницы для вскрытия	Инструменты для тонкой науки	14061-09	Первоначальное препарирование ножницами
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	60319-02-03
Fluorescein sodium	Fluka	46960
Встроенный нагреватель раствора	Warner Instruments	SH27-B	<
щипцы для ламинэктомии	Инструменты для тонкой науки	11223-20	Щипцы для первичного рассечения
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Горка микроакведука	Bioptechs	130119-5
Предметные стекла микроскопа	Fisher	12-544-3	For fluorescein slide
Столик для микроскопа insert	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Система обогрева объектива	Okolab		Oko Touch с объективным воротником
Объективное масло - тип A	Nikon	discontinued	<
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
Хлорид калия	Fisher	P217
Фосфат калия	Sigma-Aldrich	P0662
Бикарбонат натрия бикарбонат натрия	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	<
Шприцевой насос	Sage Instruments	Model 355
Адаптер для трубок - женский	Small Parts Inc.	1005109
Адаптер для трубок - male	Small Parts Inc.	1005012	<
Tygon tubing	Bioptechs		1/16" ID, толщина стенки 1/32" толщина
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	тонкие ножницы

tr style='height:20px;' >tr style='height:20px;' >tr style='height:21px;' >tr style='height:21px;'>tr style='height:21px;' >