Таргетная абляция нейронов с помощью двухфотонной микроскопии у рыбки данио-рерио

Аннотация

Источник: Муто, А., {{}}et al{{}}. Абляция нейронной популяции с помощью двухфотонного лазера и ее оценка с помощью визуализации кальция и поведенческой записи у личинок рыбок данио. J. Vis. exp.} (2018){{}}
}

В этом видео Продемонстрирована процедура двухфотонной лазерной абляции, позволяющая избирательно разрушать флуоресцентные нейроны у личинок данио-рерио, иммобилизованных агарозой. Визуализация с высоким разрешением до и после процедуры подтверждает эффективное повреждение нейронов, о чем свидетельствует отсутствие флуоресценции.

Протокол

1. абляция субпопуляции нейронов с помощью двухфотонного лазерного микроскопа

1. Начните с настройки сопряжения линии Gal4, которая обозначает конкретные нейроны, подлежащие изучению, и UAS:EGFP или UAShspzGCaMP6s. Обязательно используйте фон nacre для обоих родителей, чтобы можно было получить nacre гомозиготы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гомозиготы nacre не содержат меланофоров на поверхности тела (Рисунок 1B). В настоящем исследовании используется линия Gal4 gSAIzGFFM119B (которая обозначает pretectum) и другая линия Gal4 hspGFFDMC76A (которая обозначает ILH (долю гипоталамуса).

2. На следующий день после начала вязки соберите яйца данио-рерио и поднимите их до личиночной стадии, на которой интересующие нейроны будут экспрессировать флуоресцентных репортеров.

3. Установите личинку данио-рерио в агарозе с низкой температурой плавления 2% (Рисунок 1B).

1. Начните с приготовления 2% раствора агарозы: растворите 2 г агарозного порошка с низкой температурой плавления в 100 мл воды системы (т.е., вода, используемая для содержания взрослых рыбок данио-рерио в циркуляционной системе водоснабжения) или вода E3, доведя воду до точки кипения в микроволновке и энергично перемешав.

   1. Разогрейте в микроволновке агарозный бульон с низкой температурой плавления 2% до кипения. Вылейте 3,5-4,0 мл агарозы на крышку 6-сантиметровой чашки Петри. Подождите, пока агароза остынет, чтобы она была теплой на ощупь, прежде чем продолжить.

   2. Далее поместите одну личинку (не обезболенную на этом этапе) в агарозу. Продолжайте регулировать положение и ориентацию личинки так, чтобы она находилась вертикально, с помощью иглы для препарирования (рисунок 1C), пока агароза не затвердеет, чтобы обеспечить правильное положение личинки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Личинка будет продолжать плавать, пока агароза затвердевает.

   3. Как только личинка будет размещена, подождите 5 минут, пока агароза полностью застынет.

   4. Налейте 5 мл раствора трикаина (0,4% при 1x рабочей концентрации) на агарозу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать движений личинок во время лазерной абляции, личинки должны находиться под наркозом на протяжении всей процедуры абляции.

4. Удалите личинку с помощью функции обесцвечивания в двухфотонной лазерной микроскопической системе.

1. Поместите внедренную в агарозу личинку под двухфотонный лазерный сканирующий микроскоп и запустите систему микроскопии.

2. Запустите программное обеспечение для получения изображений и нажмите кнопку "Вкл." на вкладке "Лазер", чтобы включить лазер (Figure 1D). Подождите, пока «Статус» лазера изменится с «Занят» на «Режим заблокирован».

3. На вкладке "Каналы" установите длину волны лазера на 880 нм (максимальная мощность: примерно 2,300 мВт) для абляции EGFP (улучшенный зеленый флуоресцентный белок) или на 800 нм (максимальная мощность: примерно 2,600 мВт) для абляции GCaMP.

4. Выберите объектив 20X, вручную переместив объектив револьвера. Перейдите на вкладку «Найти», нажмите «GFP» (зеленый флуоресцентный белок), чтобы изменить оптические пути и непосредственно просмотреть флуоресценцию на глаз.

5. Найдите мозг личинки данио-рерио в центре обзора; затем нажмите на вкладку "Получение", чтобы вернуться к двухфотонной микроскопии.

6. В качестве записи состояния 'до абляции' сделайте изображение z-stack с объективом 20X с высокой скоростью сканирования (чтобы избежать теплового повреждения). Позже сравните изображения, сделанные до и после экспериментов по абляции (рис. 2A). Чтобы получить z-стек, нажмите «Z-Stack», чтобы выбрать опцию z-stack и развернуть вкладку. Установите нижний предел (нажмите кнопку «Установить первым») после фокусировки на вентральном конце мозга личинки, и установите верхний предел (нажмите кнопку «Установить последним») после фокусировки на самой дорсальной поверхности мозга. Затем нажмите кнопку «Начать эксперимент», чтобы запустить получение изображения z-stack.

7. Выберите объектив 63X, вручную перемещая объектив револьвера.

8. Нажмите на вкладку "Найти", чтобы переключиться на эпифлуоресцентную микроскопию, найдите клетки, которые должны быть удалены, в центре зрения рядом с глазом, затем нажмите вкладку "Получение", чтобы вернуться к лазерной сканирующей микроскопии.

5. На вкладке "Режим получения" установите "Размер кадра" на 256 x 256. Нажмите «Live» и понаблюдайте за интересующими нейронами.

6. Начиная с самой дорсальной стороны, найдите фокальную плоскость, в которой клетки, которые нужно аблять, находятся в фокусе.

7. Отметьте небольшую круглую область диаметром около одной трети размера клетки на каждом нейроне как область интереса (ROI) с помощью функции "Regions".

8. Установите скорость сканирования на 13,93 с/256 x 256 пикселей (134,42 мкм x 134,42 мкм), что соответствует времени лазерного задержки примерно 200 мкс/пиксель, или 200 мкс/0,5 мкм. Также установите 4 повторения («Цикл итерации: 4»). В качестве альтернативы можно оптимизировать количество итераций и скорость сканирования таким образом, чтобы была достигнута достаточная абляция.

9. Выполните функцию 'Bleaching' для абляции в сочетании с 'Временным рядом (2 цикла)' для отображения образца (до и после абляции) и 'Regions' (для установки ROI) или эквивалентными функциями в используемом программном обеспечении (Рисунок 1D) .

10. Сравнивая первое изображение (до абляции) и второе изображение (после абляции) в цикле временных рядов, убедитесь, что после обесцвечивания флуоресценция в целевых клетках уменьшается до уровня, наблюдаемого на уровне фона (рис. 2B).

11. Если флуоресценция все еще присутствует после абляции, увеличьте количество итераций.

12. Затем переместите фокальную плоскость немного глубже (i.e., ближе к вентральной стороне) и выберите следующую фокальную плоскость, где появляются неабляционные ячейки.

13. Выполните функцию отбеливания. Повторяйте эти шаги до тех пор, пока не будут удалены все клетки в интересующей нервной структуре.

14. После прохождения по всем фокальным плоскостям, охватывающим нейронные структуры, которые нужно аблять, проверьте клетки на наличие отмененной флуоресценции. Если обнаруживается, что некоторые клетки все еще флуоресцентны из-за недостаточной абляции, облучите их лазером снова, как описано выше.

15. Если личинку нужно извлечь из агарозы после лазерного облучения, не пытайтесь вытолкнуть ее из агарозы, потому что это может повредить личинку. Вместо этого аккуратно сделайте крошечные надрезы в агарозе вокруг личинки перпендикулярно поверхности ее тела. Затем подождите, пока личинка выплывет из агарозы самостоятельно, когда действие анестетика закончится.

16. Перейдите к следующей личинке для абляции или проведите контрольные эксперименты с использованием другой популяции нейронов, которые не участвуют в исследуемом поведении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, в качестве контроля, нейроны обонятельной луковицы в UAS:EGFP; личинки gSAIzGFFM119B были лазерно абляированы с использованием того же протокола, что и выше (Рисунок 2A, справа).

17. Подождите несколько часов или 1 день на восстановление, прежде чем переходить к визуализации Ca или записи поведения. В течение этого времени восстановления проверьте состояние личинок (i.e., нормальное самопроизвольное плавание, отсутствие видимых тепловых повреждений вокруг удаленной области, etc.) и удалите личинок, показывающих какие-либо признаки плохого здоровья.

Результаты

Материалы