Двухфотонная микроскопия для визуализации микроциркуляторного русла мозга мыши in vivo

Аннотация

Source: Nishimura, C. Количественная оценка архитектуры сосудов головного мозга с помощью двухфотонной микроскопии на мышиной модели нейровоспаления, вызванного ВИЧ.J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует визуализацию in vivo корковых капилляров в мозге мыши с помощью двухфотонной микроскопии. В нем описаны этапы введения флуоресцентного красителя мыши, находящейся под наркозом, с тонким корковым окном черепа, подготовки к визуализации и получения подробных изображений микрососудистых структур мозга для анализа.

Протокол

1. Инъекция флуоресцентного красителя

1. Ущипните кожу мыши, находящейся под наркозом, на медиальной левой поверхности бедра с помощью щипцов #5. Аккуратно потяните кожу вверх и ножницами разрежьте и снимите кожу. Готовят конъюгированный с красителями родамин (70 кДа) (10 мг/кг, растворенный в физрастворе).
3. Согните иглу 30 G под углом примерно 30 градусов, прижав ее к твердой поверхности скошенной стороной вверх. Наполните иглу красителем и выбросьте лишнюю жидкость, оставив образец объемом 100 мкл.

2. In vivo двухфотонная визуализация

1. Переместите хирургический аппарат в двухфотонный микроскоп, убедившись, что уровень анестезии непрерывен. Поместите небольшое количество 0,9 % физиологического раствора в резервуар для оголовья и опустите объектив микроскопа так, чтобы он соприкасался с физиологическим раствором. Определите местоположение области интереса с помощью объектива «Светлое поле».
2. Обратите внимание, что в этих экспериментах мы использовали декстран, конъюгированный с красителем родамина, который возбуждался на длине волны 780 нм. Для обнаружения флуоресценции красителя использовался полосовой эмиссионный фильтр 607/36, а для обнаружения артериальной автофлуоресценции использовался полосовой эмиссионный фильтр 480/20.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
T/PUMP	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer	Datex Ohmeda	447
Extra Fine Bonn Scissors	Инструменты для изучения науки	14084-08
Dumot #5 Щипцы	Инструменты для изобразительной науки	11295-10
Texas Red-dextran (70,000 МВт, 10 мг/кг растворенный в физрастворе)	Invitrogen	D-1830
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Spectra-Physics
Amira Software	Визуализация лица