Двухфотонная микроскопия для визуализации микроциркуляторного русла мозга мыши in vivo

Аннотация

Source: Nishimura, C. Количественная оценка архитектуры сосудов головного мозга с помощью двухфотонной микроскопии на мышиной модели нейровоспаления, вызванного ВИЧ.J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует визуализацию in vivo корковых капилляров в мозге мыши с помощью двухфотонной микроскопии. В нем описаны этапы введения флуоресцентного красителя мыши, находящейся под наркозом, с тонким корковым окном черепа, подготовки к визуализации и получения подробных изображений микрососудистых структур мозга для анализа.

Протокол

1. Инъекция флуоресцентного красителя

1. Ущипните кожу мыши, находящейся под наркозом, на медиальной левой поверхности бедра с помощью щипцов #5. Аккуратно потяните кожу вверх и ножницами разрежьте и снимите кожу. Готовят конъюгированный с красителями родамин (70 кДа) (10 мг/кг, растворенный в физрастворе).
3. Согните иглу 30 G под углом примерно 30 градусов, прижав ее к твердой поверхности скошенной стороной вверх. Наполните иглу красителем и выбросьте лишнюю жидкость, оставив образец объемом 100 мкл.

2. In vivo двухфотонная визуализация

1. Переместите хирургический аппарат в двухфотонный микроскоп, убедившись, что уровень анестезии непрерывен. Поместите небольшое количество 0,9 % физиологического раствора в резервуар для оголовья и опустите объектив микроскопа так, чтобы он соприкасался с физиологическим раствором. Определите местоположение области интереса с помощью объектива «Светлое поле».
2. Обратите внимание, что в этих экспериментах мы использовали декстран, конъюгированный с красителем родамина, который возбуждался на длине волны 780 нм. Для обнаружения флуоресценции красителя использовался полосовой эмиссионный фильтр 607/36, а для обнаружения артериальной автофлуоресценции использовался полосовой эмиссионный фильтр 480/20.

Материалы