Флуоресцентная визуализация агрегации белка PolyQ в нейронах Caenorhabditis elegans

Аннотация

Источник: Pigazzini, M. L., et. al. Характеристика амилоидных структур при старении C. Elegans использование флуоресцентного визуализации в течение жизни. J. Vis. Exp. (2020).

Это видео демонстрирует использование флуоресцентной микроскопии с визуализацией в течение жизни (FLIM) для оценки агрегации белка polyQ в C. elegans нейроны, сравнивая контрольных и шаперонов с дефицитом белка. Повышенная агрегация у червей с дефицитом шаперона способствует передаче энергии между кластеризованными флуорофорами, сокращая время жизни флуоресценции. Карты с цветовой кодировкой, сгенерированные FLIM, отображают эти различия, выделяя уровни агрегации между экспериментальными группами.

Протокол

1. Получение данных FLIM

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе время жизни флуорофора регистрируется методом TCSPC во временной области. FLIM требует, чтобы лазер генерировал световой импульс с заданной и постоянной частотой повторения. Частота повторения варьируется в зависимости от типа лазера и должна быть известна пользователю. Измерения в течение всего срока службы достигаются с помощью детекторов и электронного оборудования, установленных рядом с обычным микроскопом. В этом протоколе измерения выполняются на трех различных лазерных сканирующих конфокальных микроскопах с детекторами и программным обеспечением, предоставленными двумя разными компаниями (Table of Materials) для получения данных о сроках жизни mRFP, CFP и YFP соответственно. Перед запуском убедитесь, что установлены правильные фильтры излучения/возбуждения, и минимизируйте любой фон или подсветку монитора. Перед началом любого эксперимента установите фотостабильность выбранного флуорофора. Если флуорофор обесцвечивается в течение короткого времени в тканях нематоды, он не подходит для измерений FLIM у C. elegans.

1. Откройте программное обеспечение для сбора данных FLIM. Программное обеспечение FLIM также позволяет управлять конфокальным микроскопом. Найдите вкладку/кнопку, чтобы включить выходы детектора, и нажмите Включить выходы.
2. Получите функцию отклика прибора (IRF), которая описывает точность синхронизации настройки прибора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг следует выполнить предпочтительно перед установкой нематод.
   1. Если возможно, снимите фильтры возбуждения/выброса.
   2. Положите пустой покровный лист над мишенью и найдите его поверхность. Запишите сигнал рассеяния, полученный от покровного стекла, в течение как минимум 30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для времени жизни в несколько наносекунд программное обеспечение для сбора данных может автоматически оценить сдвиг IRF. Всегда рекомендуется приобретать IRF.
3. Поместите слайд с установленным C. elegans на сцене. Использование объектива с 10-кратным увеличением в режиме пропускания и локализация положения нематод на предметном стекле.
4. Снимите предметное стекло, переключите объектив на объектив с 63-кратным увеличением и нанесите необходимую среду для погружения (например, масло). Установите слайд на столик и локализуйте нематоды.
5. Найдите Pinhole Manager} на программном обеспечении для сбора данных и откройте его для Maximum. Начните сканирование образца, выберите интересующую область (например, голову, верхнюю часть тела) и сфокусируйтесь на его максимальной проекционной плоскости.
6. Контролируйте частоту лазерных импульсов и три других значения, присутствующих в интерфейсе программного обеспечения: Дискриминатор постоянной доли (CFD), Время амплитуды (TAC) и }Аналого-цифровой преобразователь (АЦП).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лазер должен иметь максимальный вентиль 1 x 10⁸ количество одиночных фотонов. Это число представляет собой максимальное количество фотонов, подаваемых лазером. Вычислительная гидродинамика предоставляет информацию о получении детектором однофотонного импульса относительно лазерного импульса. Это значение должно быть примерно 1 x 10⁵. TAC различает время обнаружения одного фотона и следующего лазерного импульса. Наконец, АЦП преобразует напряжение TAC в сохраняемый сигнал памяти. CFD, TAC и АЦП должны иметь одинаковые значения, чтобы гарантировать, что фотоны, испускаемые флуорофором, не будут потеряны. Правильная оценка этих параметров гарантирует, что будет собрано достаточное количество фотонов для создания точной карты времени жизни.
7. В интерфейсе программного обеспечения FLIM просмотрите количество обнаруженных фотонов: значение АЦП должно быть от 1 x 10⁴ и 1 x 10⁵. При необходимости сместите фокус в другую плоскость или увеличьте мощность лазера, чтобы собрать больше фотонов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В общем случае, количество регистрируемых фотонов в секунду не должно превышать 1% от частоты повторения лазера.
8. В строке меню выберите вкладку для установки параметров сбора. Выберите scan sync in, чтобы разрешить обнаружение одного фотона.
9. Установите фиксированное время сбора данных или фиксированное количество фотонов. Например, можно получить кривую затухания за весь срок службы в течение 2 минут или до тех пор, пока количество фотонов в одном пикселе не достигнет 2000 одиночных событий. Нажмите Старт, чтобы начать захват.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разные флуорофоры потребуют разных возбуждающих и эмиссионных лазеров и фильтров. В зависимости от яркости образца мощность лазера также можно регулировать, что не помешает сроку службы. Эти протоколы используют следующие настройки возбуждения/излучения: YFP ex500/em520-50 нм, mRFP ex561/em580-620 нм. Импульсный двухфотонный лазер был использован для измерений CFP с использованием ex800/em440 нм. Количество времени и количество фотонов, необходимых для получения карты FLIM, должны быть установлены эмпирически для каждой установки и каждой экспериментальной цели.

2. Анализ данных FLIM с помощью программного обеспечения FLIMfit

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните анализ данных с помощью программного инструмента FLIMfit, разработанного в Имперском колледже Лондона (см. Рисунок 1).

1. Откройте программное обеспечение и импортируйте файлы данных FLIM через Файл | Загрузите данные FLIM. Загрузите все образцы из одного состояния, даже если они получены в разных сеансах и из разных биологических повторов.
2. При необходимости сегментируйте одну нематоду с любого изображения FLIM с помощью Сегментация | Менеджер сегментации. Перетащите инструмент обрезки вокруг области видимости, пока она не будет выделена. После завершения нажмите OK.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сегментация должна быть выполнена для всех изображений.
3. Выберите небольшую область, где отображается изображение C. elegans} (Рисунок 1, Стрелки 1). Кривая распада этой области появится в большом окне затухания в правой части интерфейса (Рисунок 1, стрелка 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Распад может отображаться линейно или логарифмически.
4. Установите правильные параметры для экстраполяции времени жизни с помощью алгоритма программного обеспечения, как описано в шагах 2.5-2.8.
5. На вкладке Данные (Рисунок 1{{}}, Стрелка 3):{{}}
   1. }Установите произвольное значение {{TAG_351 TAG_352}}{{}}, чтобы исключить пиксели, которые слишком тусклые для создания Хорошая посадка. В зависимости от выборки C. elegans это значение варьируется от 40 до 300. Вводите различные значения до тех пор, пока не будет достигнут удовлетворительный предварительный просмотр.
   2. Выберите число Time Min} и Time Max), чтобы ограничить сигнал FLIM этими значениями. Все события, которые появляются до и после этого порога, будут исключены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для анализа mRFP были исключены события до 800 пс и после 4,000 пс. Эти значения зависят от срока службы флуорофора и должны быть определены конечным пользователем.
   3. Не изменяйте предустановку Counts/Photon из 1.
   4. Введите Частота повторения в МГц лазера, используемого во время захвата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для текущего протокола использовались разные лазеры с разной частотой повторения. Двухфотонный лазер, используемый для регистрации времен жизни CFP, имеет частоту повторения 80 МГц, для YFP лазер повторяется на частоте 40 МГц, а для mRFP значение составляет 78,01 МГц. Эти значения были введены в FLIMfit в соответствии с анализируемым образцом.
   5. Введите значение Gate Max, чтобы исключить все насыщенные пиксели.
      ПРИМЕЧАНИЕ:} Для измерений в течение всей жизни в C. elegans, это значение устанавливается на любое большое число (например, 1 x 10{⁸).
6. На вкладке Lifetime} выберите глобальную аппроксимацию, которая будет использоваться (например, подгонка по пикселям). Смотрите Рисунок 1, стрелка 4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: A подгонка приведет к распаду, подогнанному к каждому отдельному пикселю. Подгонка Image-wise} создаст глобальную подгонку каждого отдельного изображения и отобразит одну пожизненную ценность для каждого изображения. Подгонка Global-wise} создаст одну аппроксимацию для всего набора данных. Для всех изображений предоставляется одно значение времени жизни.
7. Не изменяйте никаких других параметров, кроме No. Exp, если известно, что выбранное затухание флуоресценции является мультиэкспоненциальным и проявляет более одного времени жизни.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем протоколе эта функция использовалась для вычисления времени жизни биэкспоненциального флуорофора CFP.
8. Загрузите IRF через меню IRF: IRF | Загрузите IRF. Чтобы оценить сдвиг IRF, выберите IRF | Оценка сдвига IRF. Набор значений автоматически появится на вкладке IRF. Как только это будет установлено, не изменяйте никакие другие параметры этой вкладки.
9. }Как только все параметры будут установлены, нажмите {{}}} (}Рисунок 1, Стрелка 5). Алгоритм выполнит подгонку кривой затухания и установит значение времени жизни для каждого изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Результирующая посадка, выделенная синей линией, должна перекрываться со всеми событиями. Хорошая посадка получается, когда все события выровнены по посадке.
10. Нажмите на вкладку Параметры} (Рисунок 1, стрелка 6), расположенную в верхнем правом меню интерфейса программного обеспечения, и выберите Статистика: w_mean (средневзвешенное значение) и проверьте, что chi2{{ TAG_598}} максимально близко к 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: A chi2 близко к единице обеспечивает точность подгонки. Таким образом, значение времени жизни выбранного изображения раскрывается как tau_1.
11. Экспортируйте любую интересующую информацию: Файл | Экспорт изображений интенсивности/Таблица результатов подгонки/Изображения/Гистограммы. Сохраните настройки данных, использованные для расчета времени жизни: Файл | Сохранить настройки данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые параметры будут сохранены для будущего анализа выбранных образцов.

3. Графическое представление данных FLIM

ПРИМЕЧАНИЕ: Время жизни, собранное из разных образцов, может быть визуально представлено различными способами. Выберите для обозначения значений времени жизни в наносекундах или пикосекундах.

1. Покажите качество подгонки и точность кривой, экспортировав кривую затухания непосредственно из FLIMfit.
2. Представьте распределение фотонов путем построения графика зависимости частоты количества фотонов от значения времени жизни на гистограмме.
3. Наконец, для статистического сравнения при сравнении двух или более выборок поместите значения времени жизни плюс стандартное отклонение среднего значения в столбчатую диаграмму точечной диаграммы. Выполните любой желаемый статистический анализ.

Результаты

Материалы