Визуализация тромба головного мозга у мыши с помощью микрокомпьютерной томографии

Аннотация

Источник: Kim, D., et. al. Комбинированная флуоресцентная визуализация в ближнем инфракрасном диапазоне и микрокомпьютерная томография для непосредственной визуализации тромбоэмболии головного мозга. J. Vis. Exp. (2016)

Это видео демонстрирует визуализацию тромба головного мозга у мышей с помощью микрокомпьютерной томографии (микро-КТ). В мышиную модель мозгового тромба вводят наночастицы золота, нацеленные на фибрин, действующие как контрастный агент. Мышь помещается на ложе аппарата микрокомпьютерной томографии, и изображения получаются под разными углами. С помощью соответствующего программного обеспечения изображения реконструируются и обрабатываются.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Приготовление экзогенно сформированного сгустка, меченного флуоресцентным маркером (рис. 1)

1. Обезболить мышь в индукционной камере с использованием 3% изофлурана, смешанного с 30% кислородом (1,5 л/мин 100% кислорода). Обеспечьте достаточную глубину анестезии, наблюдая за мышечным тонусом и подтверждая отсутствие рефлекса защемления пальца ноги.
2. Поместите животное на стерильную простыню в положение лежа и держите его под анестезией, используя ингаляционную маску и 2% изофлурана, смешанного с 30% кислородом. Выполните следующие процедуры с использованием асептических техник и стерильных халатов/масок/перчаток/инструментов. Поддерживайте стерильные условия, очищая и дезинфицируя экспериментальную зону 70% спиртом до и после процедур.
3. Соберите около 300 ~ 1 000 μл артериальной крови после пункции сердца. Смешайте 70 мкл цельной крови с 30 мкл зонда C15 (концентрация 20 моль/л), флуоресцентным зондом Cy5,5, чувствительным к фибрин-сшивающей активности фермента свертывания активированного фактора XIII (FXIIIa), чтобы флуоресцентно пометить сгусток (Рисунок 1A). Введите смешанную кровь с помощью шприца объемом 3 мл (игла 23 калибра) в полиэтиленовую трубку длиной 20 см (ПЭ-50, внутренний диаметр 0,58 мм). Полиэтиленовые трубки должны быть стерилизованы (или сертифицированы производителем как стерильные), а сгустки должны быть подготовлены асептически в вытяжке для культуры тканей.
4. Убедитесь в смерти животного, наблюдая за отсутствием дыхания и сердечного пульса.
5. Оставьте насыщенную кровью пробирку при комнатной температуре на 2 часа, затем при 4 °C на 22 часа и выполните следующие процедуры, как сообщалось ранее.
6. Разрежьте тромбосодержащую трубку на кусочки длиной 1,5 см. С помощью шприца объемом 3 мл, наполненного фосфатно-солевым буфером (PBS), выведите тромб на 6-луночный планшет, содержащий PBS, осторожно вводя PBS в каждый кусок пробирки. Промойте тромбы три раза PBS (Рисунок 1B).
7. Загрузите дистальный конец трубки PE-10 длиной 15 см (внутренний диаметр 0,28 мм) с помощью тромба длиной 1,5 см, осторожно вытягивая промытый тромб, избегая пузырьков воздуха, с помощью шприца, наполненного физиологическим раствором объемом 1 мл с иглой 30 калибра, которая вводится в проксимальный конец трубки.
8. Соедините нагруженную тромбом трубку PE-10 с трубкой PE-50 длиной 3 см (внутренний диаметр 0,58 мм), модифицированной для получения конического конца (внутренний диаметр 200 мкм), которая будет размещена на участке бифуркации средней мозговой артерии (МКА) – передней мозговой артерии (ВДК) внутренней сонной артерии (ВСА) на мышиной модели эмболического инсульта (Рисунок 1C).

2. Моделирование мышиной модели тромбоэмболического инсульта (рис. 2)

1. Обезболить другую мышь, которую нужно погладить, в индукционной камере с использованием 3% изофлурана, смешанного с 30% кислородом (1,5 л/мин). Введите мелоксикам (5 мг/кг) подкожно для облегчения послеоперационной боли. Обеспечьте достаточную глубину анестезии, наблюдая за мышечным тонусом и подтверждая отсутствие рефлекса защемления пальца ноги.
2. Нанесите небольшое количество ветеринарной мази на каждый глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии. Выполните следующие хирургические процедуры с использованием асептических техник и стерильных халатов/масок/перчаток/инструментов. Поддерживайте стерильные условия, очищая и дезинфицируя операционную область 70% спиртом до, во время и после операции.
3. Переместите мышь на операционный стол. Поместите животное на стерильную простыню в положение лежа и держите под наркозом с помощью ингаляционной маски и 2% изофлурана. Затем зажмите температуру тела на уровне 36,5 °C с помощью гомеотермического одеяла с обратной связью от ректального термометра.
4. После хирургической подготовки с бетадином и 70% спиртом сделайте вертикальный разрез на 1 см с помощью скальпеля на коже головы между левым ухом и глазом. Приклейте дистальный конец оптического волокна лазерного доплеровского флоуметра на обнаженную левую височную поверхность кости (на 1 мм слева и на 4 мм ниже брегмы). Затем запустите доплеровский мониторинг потока (Рисунок 2A).
5. Уложите животное. Выпрямите шейку, потянув за верхний передний зуб с помощью веревки, прикрепленной к штифту, и побрейте область шеи. Затем сделайте вертикальный разрез по средней линии диаметром 3 см, раскройте его и обнажите область левой сонной луковицы, рассекая перисосудистые мягкие ткани. Будьте осторожны, чтобы не травмировать блуждающий нерв.
6. Перевязать левую проксимальную общую сонную артерию (ОСА) с помощью стерильного шва из черного шелка 6-0, а левую ВСА и левую крыло-небную артерию (ППА) с помощью стерильных швов черного шелка 7-0.
7. Прижгите левую верхнюю щитовидную артерию, которая является ветвью левой наружной сонной артерии, с помощью монополярного электрического прижигания и перевязайте левую проксимальную наружную сонную артерию (ЭКА) свободно, а более дистальный участок плотно с помощью стерильных швов черного шелка 7-0.
8. С помощью микроножниц сделайте небольшое отверстие (около 0,2 ~ 0,25 мкм в диаметре) между перевязанными участками ЭКА.
9. Вставьте тромбосодержащий катетер в отверстие в ЭХА, ослабляя проксимальную лигацию ЭХА. Снова затяните проксимальную лигацию ECA после введения катетера в CCA, чтобы зажать катетер на месте.
10. Прижигайте для разрезания дистальной части ЭХА, которая находится дистальнее места дистального лигирования, и поворачивайте свободную проксимальную ЭХА по часовой стрелке, чтобы выровнять ее в направлении ВСА, одновременно извлекая катетер из ОСА. Затем продвинуте катетер примерно на 9 мм в область бифуркации MCA-ACA дистального отдела ICA сразу после ослабления лигирования ICA. Затем подтяните лигирование ВСА.
11. Поместите тромб в область бифуркации, осторожно надавливая на шприц на 1 мл для введения тромба. Проверьте снижение допплеровского мозгового кровотока (КБТ), которое должно быть снижено на 30% или ниже по сравнению с исходным уровнем, если тромб успешно окклюзил сосуд (Рисунок 2B).
12. Удалите катетер и немедленно и плотно перевяжите проксимальный участок ECA. Кроме того, отменить CCA и PPA.
13. Закройте место разреза шелковыми швами 6-0. Прекратите анестезию после продолжения допплеровского мониторинга в течение необходимого промежутка времени (в данном случае, в течение 30 минут после введения тромба). Верните мышь в пустую клетку и держите ее в тепле с помощью нагревательной лампы. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения за грудиной.

3. In Vivo Микрокомпьютерная томография тромба головного мозга (рис. 3)

{{}}
1. Повторно обезболивайте мышь 2% изофлураном, как описано в шаге 2.1, в заранее указанный момент времени (в данном случае через 1 час) после начала эмболического инсульта из-за размещения тромба в мозговой артерии. Обеспечьте достаточную глубину анестезии, подтвердив отсутствие рефлекса защемления пальца ноги. Нанесите небольшое количество ветеринарной мази на каждый глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
2. Ресуспендируйте наночастицы золота, нацеленные на фибрин (fib-GC-AuNP4), в концентрации 10 мг Au/мл в 10 мМ PBS и обрабатывайте агент для визуализации тромба в течение 30 минут, чтобы обеспечить растворение и диспергирование наночастиц. Введите 300 мкл fib-GC-AuNP (10 мг/мл) в вену полового члена.
3. Поместите животное на кровать аппарата микрокомпьютерной томографии и выпрямите шею, потянув за верхний передний зуб с помощью веревки, прикрепленной к штифту, чтобы уменьшить артефакты движения.
4. Через 5 мин после введения fib-GC-AuNP начинают получать микро-КТ изображения головного мозга. Для описанных здесь экспериментов используйте следующие параметры визуализации: 65 кВпик, 60 мкА, 26,7 x 26,7 x 27,9 мм³, 0,053 x 0,053 x 0,054 мм³ размер вокселя, 100 миллисекунд на кадр, одно усреднение, 360 просмотров, 512 x 512 матрица реконструкции, 600 срезов, Время сканирования 64 сек.
5. Верните мышь в пустую клетку и согрейте ее с помощью нагревательной лампы. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения за грудиной.
6. Преобразуйте необработанные данные изображения в формат Digital Imaging and Communications in Medicine (DICOM) с помощью команды 'Start' панели 'Reconstruction' в программном пакете, установленном на микрокомпьютерном томографе.
7. Для количественного анализа изображений (на шаге 6) преобразуйте данные DICOM в формат TIFF с помощью коммерчески доступного программного пакета в соответствии с инструкциями производителя.
8. Для качественного анализа, а также для количественного анализа более простым и быстрым способом, используйте программный пакет и исходные изображения толщиной 0,054 мм в формате DICOM для создания нового набора аксиальных и корональных изображений, визуализированных толщиной 1 или 2 мм (в данном случае 2 мм), следующим образом.
   1. Выберите папку DICOM в дереве "Data Source", нажмите правую кнопку мыши и импортируйте папку в "MasterDB" или "PrivateDB".
   2. Нажмите на 'MasterDB' или 'PrivateDB' в дереве "Источник данных" и выберите импортированную папку. После нажатия на вкладку «3D» на крайней левой панели, когда появится окно «Параметры загрузки», нажмите «OK», чтобы импортировать последовательность изображений в папке в виде стопки.
   3. Измените представление изображения на формат проекции максимальной интенсивности (MIP), щелкнув слово «MRP» в окне осевого и коронального изображений и выбрав «MIP» во всплывающем меню. Затем измените толщину изображения на 2 мм, нажав 'TH : 0 [mm]' в том же окне.
   4. Используя полосу 3D-навигатора шириной 2 мм, которая позволяет изучить стек изображений и нарезать его под соответствующим углом и местоположением, подготовьте изображение осевого сечения толщиной 2 мм с полным покрытием виллизиева круга (COW), в котором находятся тромбы. Нажмите кнопку захвата (значок камеры) на панели 'Output'. Сохраните изображение в формате TIFF.
9. Затем подготовьте пять изображений коронального среза толщиной 2 мм, которые охватывают непрерывно от лобной доли до мозжечка.
   1. Во-первых, подготовьте второй срез, тщательно выровняв полосу навигатора на осевом изображении, чтобы корональное изображение могло наилучшим образом визуализировать тромбы MCA-ACA.

Затем приготовьте остальные четыре ломтика непрерывным образом. Нажмите кнопку захвата (значок камеры) на панели 'Output'. Сохраните изображения в формате TIFF.

Результаты

Рисунок 1: Обзор приготовления флуоресцентно меченного сгустка крови. (А) Смешивание свежей цельной крови с ближним инфракрасным флуоресцентным зондом (NIRF) Cy5,5 (C15), который ковалентно связан с фибриновыми нитями тромба посредством ферм...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Machines
microCT	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	Polaris-G90
Perimed	, Стокгольм, Швеция	Система PeriFlux 5000
Хирургический микроскоп	Leica Microsystems, Сеул, Корея	EZ4HD
Аппарат для ингаляционной анестезии	PerkinElmer, Массачусетс, США	XGI-8
Программное
для управления NFR	NanoFocusRay, Чонджу, Корея	NFR Polaris-G90	программное обеспечение для управления микрокомпьютерной томографией
Lucion	Infinitt, Сеул, Корея	Программное обеспечение для 3D-визуализации	Lucion
Лабораторная диаграмма 7	ADInstruments, Колорадо, США	Лабораторная диаграмма 7	программное обеспечение rCBF
Image J Wanye	Rasband, NIH, США	1.49d	анализ изображений
Устройства/инструменты
Инфузионный насос	Гарвард, Массачусетс, США	насос 22( 55-2226)
Гомеотермическое одеяло	Panlab, Барселона, Испания	HB101
Карманное прижигание	Daejong, Сеул, Корея	DJE-39
Мозговая матрица	Ted pella, CA, США	15003	корональное сечение
PE-50 трубка	Natsume, Токио, Япония	SP-45(PE-50)	I.D. 0,58 мм Наружный диаметр 0,96 мм
PE-10 трубка	Нацумэ, Токио, Япония	SP-10(PE-10)	I.D. 0,28 мм Наружный диаметр 0,61 мм
Игла 30 калибра	Сунгшим-медицинский, Сеул, Корея
Шприц	CPL-медицинский, Ансан, Корея		1 & 3 мл
Марля	Panamedic, Чхонан, Корея Скотч
	Сеул,	Корея 3M-810
Micro щипцы	Fine Science Tools, Ванкувер, Канада	11253-27	Dumont #L5
Микроножницы	Fine Science Tools, Ванкувер, Канада	15000-03	Весенние ножницы Vannas
	Fine Science Tools, Ванкувер, Канада	14084-08	8,5 см
Черный шелковый шовный материал	Ailee, Пусан,	Корея SK6071, SK728	6-0 и 7-0
Реагенты
Мелоксикам	Юхань, Сеул, Корея
Ветеринарная мазь	Novartis, Базель, Швейцария
10% повидон-йод (бетадин)	Firson, Cheon-an, Корея
Хлорид железа	Sigma, Миссури, США	157740-5G
TTC	Amresco, Огайо, США	0765-100г
Изофлуран	Хана-Фам, Кёнгидо, Корея	Ифран	100 мл
PBS	Welgene, Тэгу, Корея	LB001-02	500 мл
Синтез наночастиц
Нормальный физиологический раствор	Дайхан Фам, Сеул, Корея	48N3AF3	20 мл

NFR Лазерный доплеровский расходомер обеспечение , золота