Двухфотонная микроскопия для мониторинга динамики кальция в фоторецепторах колбочек сетчатки мыши

Аннотация

Источник: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca²⁺ Динамика в окончаниях аксонов фоторецепторов колбочек сетчатки мыши. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует использование двухфотонной микроскопии для мониторинга динамики кальция в колбочках фоторецепторов трансгенной сетчатки мыши. В нем описаны этапы подготовки срезов сетчатки, визуализации биосенсоров кальция на основе FRET и анализа изменений флуоресценции для количественной оценки уровня кальция при фоновом освещении и световой стимуляции.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Подготовка среза (10 - 15 мин)
   1. Заранее подготовьте фильтрующие мембраны из нитроцеллюлозы для среза сетчатки и стеклянные покровные стекла для крепления срезов и переноса их в камеру записи. Разрежьте нитроцеллюлозную фильтрующую мембрану на прямоугольные части размером примерно 10 х 5 мм с помощью ножниц. Разрежьте покровные стекла на прямоугольные части размером примерно 10 x 5 мм с помощью стеклорезов.
   2. Медленно погрузите предметное стекло во внеклеточный раствор близко к тканям. Аккуратно потяните за срез сетчатки, полученный от биосенсорной мыши HR2.1:TN-XL Ca²⁺}, на предметное стекло ганглиозной клеткой вверх, захватив его по самому краю с помощью пары щипцов. Этот процесс уменьшает механические повреждения и складчатость тканей.
   3. Выберите область сетчатки, которая связана с соответствующим вопросом исследования. Вырежьте прямоугольный кусок размером примерно 1 х 2 мм из выбранной области сетчатки с помощью изогнутого лезвия скальпеля. Сотрите излишки раствора вокруг ткани.
   4. Поместите фильтрующую мембрану поверх кусочка сетчатки таким образом, чтобы сторона ганглиозных клеток прилегала к мембране. Сразу же добавьте каплю внеклеточной среды на мембрану, чтобы прочно прикрепить ткань к мембране.
   5. Перенесите ткань сетчатки, установленную на мембране, в срезную камеру, содержащую свежий внеклеточный раствор.
   6. Разрежьте сетчатку на вертикальные срезы толщиной 200 мкм (Рисунок 1B) с помощью свежего лезвия бритвы, прикрепленного к измельчителю для салфеток. Поменяйте лезвие для каждой части сетчатки.
      Примечание: Лезвие бритвы должно быть идеально выровнено по поверхности дна камеры для нарезки, чтобы вся мембрана раскололась одновременно, о чем свидетельствует звук "щелчка" при резке. В противном случае лезвие может погнуться и повредить ломтик.
   7. Приклейте один срез, установленный на мембране, к стеклянному покровному стеколу, нанося высоковакуумную смазку только на концы мембраны (Рисунок 1C). Следите за тем, чтобы на стеклянной поверхности ниже сетчатки не было жира.
   8. Срезы, смонтированные на покровном стеклее, покрытые каплей внеклеточного раствора, храните в камере хранения – закрытом и светонепроницаемом контейнере, , например, чашке Петри с крышкой, покрытой алюминиевой фольгой – в атмосфере карб-кислорода при комнатной температуре (RT). Вводите карбкислород, пузыря в небольшом резервуаре для воды, чтобы поддерживать влажность атмосферы в камере выдержки; Это предотвращает пересыхание ломтиков.
   9. Дайте ломтикам постоять в камере выдержки в течение 10–15 минут, прежде чем перемещать их (один за другим) в камеру записи. Ломтики могут выдерживаться до 4-5 часов в камере выдержки при температуре RT (~21 °C).

2. Двухфотонная Ca²⁺ Визуализация

1. Двухфотонная микроскопия
   1. Используйте двухфотонный микроскоп типа подвижного объектива (MOM).
      Примечание: Любой вертикальный двухфотонный микроскоп, отвечающий следующим минимальным требованиям, может быть использован: Он должен быть оснащен (a) импульсным лазером, настраиваемым на ~860 нм, (b) минимум двумя одновременно регистрируемыми флуоресцентными каналами, (c) фильтрами для усиленного голубого флуоресцентного белка (eCFP) и флуоресценции цитринов, (d) световой стимулятор и (e) программное обеспечение, позволяющее записывать последовательности покадровых изображений с частотой кадров, достаточной для разрешения интересующих сигналов Ca²⁺.
   2. Запустите двухфотонную систему визуализации в соответствии с указаниями производителя. Строго следуйте рекомендациям по безопасности лазеров, принятым на объекте. Запустите лазер и настройте его на ~860 нм.
   3. Перенесите срез из камеры выдержки в камеру записи и немедленно начните перфузию карбоксигенированным внеклеточным раствором. Поддерживайте скорость перфузионного потока 2 мл/мин и температуру 37 °C в записывающей камере.
   4. Используйте объектив для погружения в воду с числовой апертурой (NA) 20X 0,95. Если это возможно, используйте камеру с устройством с зарядовой связью (ПЗС) в сочетании с инфракрасным светодиодом (LED) под записывающей камерой, чтобы определить местоположение среза сетчатки (Рисунок 2). В противном случае найдите срез с помощью двухфотонной визуализации (см. 2.1.5).
   5. Переключитесь на двухфотонную визуализацию для просмотра экспрессии биосенсора. Включите два канала детектирования для флуоресцентной визуализации eCFP и цитрина.
   6. Используйте программное обеспечение для получения изображений, которое управляет двухфотонным микроскопом, чтобы отсканировать и выбрать ряд конусных клемм для записи (Рисунок 3A). Установите для параметра «Захват изображений» значение 128 x 16 пикселей (31,25 Гц) или аналогичную конфигурацию. Ограничьте отсканированную область конусообразными клеммами, чтобы избежать обесцвечивания фотопигментов во внешних сегментах.
      Примечание: Для кальциевого датчика TN-XL (τ = ~0,6 сек для привязки Ca²⁺, τ = ~0,2 сек для отмены привязки Ca²⁺) рекомендуется минимальная частота кадров ~8 Гц.
   7. Стимуляция и запись света
      1. Используйте подсценический полнопольный световой стимулятор для выполнения следующих шагов.
         Примечание: Простым решением для полнопольного светового стимулятора является использование двух светодиодов с полосовым фильтром (e.g., "синий": 360 полоса пропускания (BP) 12, "зеленый": 578 BP 10), которые соответствуют чувствительности длины волны колбочек мыши, но в то же время не перекрываются с фильтрами, используемыми для обнаружения флуоресценции. Свет от светодиодов фокусируется конденсором через дно записывающей камеры (Рисунок 2).
      2. Включите лазер и дайте колбочкам адаптироваться к сканирующему лазеру и фоновому свету стимула (20 - 30 секунд) перед предъявлением световых стимулов (см. 2.2.3) или применением фармакологических средств.
      3. Начните предъявление произвольных стимулов (, например, вспышки света, как показано на рисунке Рисунок 3B, C). В случае стимулятора, описанного на шаге 2.2.1, сгенерируйте стимулы путем модуляции интенсивности двух светодиодов с течением времени с помощью микропроцессорной платы, управляемой специализированным программным обеспечением.
      4. Начните запись двух флуоресцентных каналов (e.g., на 483 нм для "синего"
   8. Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET)-донор eCFP и на 535 нм для "желтого" FRET-акцептора) с использованием соответствующего программного обеспечения для получения изображений (см. также 2.1.6). Например, в случае световых вспышек (Рисунок 3B, C) запишите не менее 8 - 10 предъявлений стимулов (испытаний).

Результаты

Рисунок 1. Подготовка вертикальных срезов сетчатки. (А) Изолированная и сплющенная сетчатка подготавливается к срезу. (В) Прямоугольный кусок сетчатки глаза (см. красную рамку в А), установленный на мембране фильтровальной бум...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Высоковакуумная смазка	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
Защитные стекла	R. Langenbrinck		24 x 60 мм; http://www.langenbrinck.com
Стеклянные слайды	R. Langenbrinck		76 x 26 мм; http://www.langenbrinck.com
Лезвия для измельчителя тканей	MARTOR KG	ARGENTAX No. 1044	0,25 мм; http://www.martor.de
Измельчитель тканей	Изготовленная по индивидуальному заказу
фильтрующая мембрана из нитроцеллюлозы с решеткой	Merck Millipore	AABG01300	Тип фильтра: 0,8 мкм; http://www.emdmillipore.com
УФ/зеленый светодиодный стимулятор полного поля	Специализированная
микропроцессорная плата с открытым исходным кодом	Arduino		http://www.arduino.cc
программное обеспечение для визуализации CfNT	Автор		: Михаэль Мюллер, MPI для медицинских исследований, Гейдельберг,
Германия IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 Системный фокус перфузионная система	ALA Scientific Instrument		с зондовым коллектором диаметром 100 мкм; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Подвижный объективный микроскоп (MOM), разработанный W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
объектив XLUMPlanFL 20x/0,95 Вт Olympus			http://www.olympusamerica.com
Leica MZ95	Микросистемы		http://www.leica-microsystems.com/

Leica