Двухфотонная микроскопия для мониторинга динамики кальция в фоторецепторах колбочек сетчатки мыши

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Подготовка среза (10 - 15 мин)
   1. Заранее подготовьте фильтрующие мембраны из нитроцеллюлозы для среза сетчатки и стеклянные покровные стекла для крепления срезов и переноса их в камеру записи. Разрежьте нитроцеллюлозную фильтрующую мембрану на прямоугольные части размером примерно 10 х 5 мм с помощью ножниц. Разрежьте покровные стекла на прямоугольные части размером примерно 10 x 5 мм с помощью стеклорезов.
   2. Медленно погрузите предметное стекло во внеклеточный раствор близко к тканям. Аккуратно потяните за срез сетчатки, полученный от биосенсорной мыши HR2.1:TN-XL Ca²⁺}, на предметное стекло ганглиозной клеткой вверх, захватив его по самому краю с помощью пары щипцов. Этот процесс уменьшает механические повреждения и складчатость тканей.
   3. Выберите область сетчатки, которая связана с соответствующим вопросом исследования. Вырежьте прямоугольный кусок размером примерно 1 х 2 мм из выбранной области сетчатки с помощью изогнутого лезвия скальпеля. Сотрите излишки раствора вокруг ткани.
   4. Поместите фильтрующую мембрану поверх кусочка сетчатки таким образом, чтобы сторона ганглиозных клеток прилегала к мембране. Сразу же добавьте каплю внеклеточной среды на мембрану, чтобы прочно прикрепить ткань к мембране.
   5. Перенесите ткань сетчатки, установленную на мембране, в срезную камеру, содержащую свежий внеклеточный раствор.
   6. Разрежьте сетчатку на вертикальные срезы толщиной 200 мкм (Рисунок 1B) с помощью свежего лезвия бритвы, прикрепленного к измельчителю для салфеток. Поменяйте лезвие для каждой части сетчатки.
      Примечание: Лезвие бритвы должно быть идеально выровнено по поверхности дна камеры для нарезки, чтобы вся мембрана раскололась одновременно, о чем свидетельствует звук "щелчка" при резке. В противном случае лезвие может погнуться и повредить ломтик.
   7. Приклейте один срез, установленный на мембране, к стеклянному покровному стеколу, нанося высоковакуумную смазку только на концы мембраны (Рисунок 1C). Следите за тем, чтобы на стеклянной поверхности ниже сетчатки не было жира.
   8. Срезы, смонтированные на покровном стеклее, покрытые каплей внеклеточного раствора, храните в камере хранения – закрытом и светонепроницаемом контейнере, , например, чашке Петри с крышкой, покрытой алюминиевой фольгой – в атмосфере карб-кислорода при комнатной температуре (RT). Вводите карбкислород, пузыря в небольшом резервуаре для воды, чтобы поддерживать влажность атмосферы в камере выдержки; Это предотвращает пересыхание ломтиков.
   9. Дайте ломтикам постоять в камере выдержки в течение 10–15 минут, прежде чем перемещать их (один за другим) в камеру записи. Ломтики могут выдерживаться до 4-5 часов в камере выдержки при температуре RT (~21 °C).

2. Двухфотонная Ca²⁺ Визуализация

1. Двухфотонная микроскопия
   1. Используйте двухфотонный микроскоп типа подвижного объектива (MOM).
      Примечание: Любой вертикальный двухфотонный микроскоп, отвечающий следующим минимальным требованиям, может быть использован: Он должен быть оснащен (a) импульсным лазером, настраиваемым на ~860 нм, (b) минимум двумя одновременно регистрируемыми флуоресцентными каналами, (c) фильтрами для усиленного голубого флуоресцентного белка (eCFP) и флуоресценции цитринов, (d) световой стимулятор и (e) программное обеспечение, позволяющее записывать последовательности покадровых изображений с частотой кадров, достаточной для разрешения интересующих сигналов Ca²⁺.
   2. Запустите двухфотонную систему визуализации в соответствии с указаниями производителя. Строго следуйте рекомендациям по безопасности лазеров, принятым на объекте. Запустите лазер и настройте его на ~860 нм.
   3. Перенесите срез из камеры выдержки в камеру записи и немедленно начните перфузию карбоксигенированным внеклеточным раствором. Поддерживайте скорость перфузионного потока 2 мл/мин и температуру 37 °C в записывающей камере.
   4. Используйте объектив для погружения в воду с числовой апертурой (NA) 20X 0,95. Если это возможно, используйте камеру с устройством с зарядовой связью (ПЗС) в сочетании с инфракрасным светодиодом (LED) под записывающей камерой, чтобы определить местоположение среза сетчатки (Рисунок 2). В противном случае найдите срез с помощью двухфотонной визуализации (см. 2.1.5).
   5. Переключитесь на двухфотонную визуализацию для просмотра экспрессии биосенсора. Включите два канала детектирования для флуоресцентной визуализации eCFP и цитрина.
   6. Используйте программное обеспечение для получения изображений, которое управляет двухфотонным микроскопом, чтобы отсканировать и выбрать ряд конусных клемм для записи (Рисунок 3A). Установите для параметра «Захват изображений» значение 128 x 16 пикселей (31,25 Гц) или аналогичную конфигурацию. Ограничьте отсканированную область конусообразными клеммами, чтобы избежать обесцвечивания фотопигментов во внешних сегментах.
      Примечание: Для кальциевого датчика TN-XL (τ = ~0,6 сек для привязки Ca²⁺, τ = ~0,2 сек для отмены привязки Ca²⁺) рекомендуется минимальная частота кадров ~8 Гц.
   7. Стимуляция и запись света
      1. Используйте подсценический полнопольный световой стимулятор для выполнения следующих шагов.
         Примечание: Простым решением для полнопольного светового стимулятора является использование двух светодиодов с полосовым фильтром (e.g., "синий": 360 полоса пропускания (BP) 12, "зеленый": 578 BP 10), которые соответствуют чувствительности длины волны колбочек мыши, но в то же время не перекрываются с фильтрами, используемыми для обнаружения флуоресценции. Свет от светодиодов фокусируется конденсором через дно записывающей камеры (Рисунок 2).
      2. Включите лазер и дайте колбочкам адаптироваться к сканирующему лазеру и фоновому свету стимула (20 - 30 секунд) перед предъявлением световых стимулов (см. 2.2.3) или применением фармакологических средств.
      3. Начните предъявление произвольных стимулов (, например, вспышки света, как показано на рисунке Рисунок 3B, C). В случае стимулятора, описанного на шаге 2.2.1, сгенерируйте стимулы путем модуляции интенсивности двух светодиодов с течением времени с помощью микропроцессорной платы, управляемой специализированным программным обеспечением.
      4. Начните запись двух флуоресцентных каналов (e.g., на 483 нм для "синего"
   8. Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET)-донор eCFP и на 535 нм для "желтого" FRET-акцептора) с использованием соответствующего программного обеспечения для получения изображений (см. также 2.1.6). Например, в случае световых вспышек (Рисунок 3B, C) запишите не менее 8 - 10 предъявлений стимулов (испытаний).

Рисунок 1. Подготовка вертикальных срезов сетчатки. (А) Изолированная и сплющенная сетчатка подготавливается к срезу. (В) Прямоугольный кусок сетчатки глаза (см. красную рамку в А), установленный на мембране фильтровальной бумаги (темно-серый) после разрезания. (с) Вид сверху на мембранный срез сетчатки, закрепленный на стеклянном покровном стеколе с помощью смазки. (Г) Схематическое изображение части среза сетчатки (см. красную рамку в C). Фоторецепторы колбочек обозначены зеленым цветом. V, брюшной; D, спинной; N, носовой; Т, височный; ОС, внешний сегмент; ONL — наружный ядерный слой; OPL, наружный плексиформный слой; INL — внутренний ядерный слой; IPL, внутренний плексиформный слой; GCL, слой ганглиозных клеток.

Рисунок 2. Двухфотонная визуализация срезов сетчатки: Иллюстрация конфигурации записи. Top: Водно-иммерсионная линза объектива, фокусирующая луч сканирующего лазера (красная стрелка вниз) на сетчатку глаза и собирающая излучаемую флуоресценцию (стрелки вверх). Объектив также собирает проходящий инфракрасный свет от светодиодного индикатора, установленного под конденсатором, при съемке среза с помощью ПЗС-камеры. Center: Срез сетчатки, установленный в записывающей камере и перфузированный внеклеточным раствором. Bottom: Конденсорная линза фокусирует свет от стимулирующих светодиодов (и инфракрасного светодиода для изображения с ПЗС-камеры) через прозрачное дно записывающей камеры в ткани сетчатки. ИК-светодиод, инфракрасный светодиод; ПЗС, устройство с зарядовой связью; БП, полосовой.

Рисунок 3. Вызванные светом ответы Ca2+ в окончаниях аксонов фоторецепторов мышиных колбочек. (А) Слева: Записи, сфокусированные на синаптических окончаниях (красный прямоугольник) колбочек фоторецепторов (зеленый) в срезах сетчатки. Right: Пример для записанного региона с 7 отдельными терминалами. Флуоресценцию регистрировали с помощью двух каналов: один для FRET-акцептора цитрин (вверху; 535 BP 50) и один для FRET-донора eCFP (внизу; 480 BP 32). (В) Вызванные светом изменения флуоресценции цитринов (FA) и eCFP (FD), зарегистрированные в одном ROI. (с) Ca2+ отклики (как отношение FA/FD) конусного терминала к серии ярких световых вспышек в 1 секунду с интервалом в 5 секунд. ROI, регион интересов; БП — полосовой фильтр; F, интенсивность флуоресценции; а.е., условные единицы; FRET, резонансный перенос энергии Фёрстера; eCFP, усиленный голубой флуоресцентный белок. Интенсивность стимула (как скорость фотоизомеризации в 103·P·s-1 на колбочку): 13,0 и 12,8 для M- и S-опсинов соответственно, добавляя к фоновому уровню (= светодиоды выключены, возбуждающее лазерное сканирование) ~10.