Визуализация миграции глиального ядра Мюллера в живых клетках во время регенерации сетчатки данио-рерио

Аннотация

Источник: Лане, М., et.al. Культура взрослых трансгенных эксплантов сетчатки данио для визуализации живых клеток с помощью многофотонной микроскопии. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует визуализацию миграции глиального ядра Мюллера в живых клетках в индейских эксплантах сетчатки рыбок данио-рерио после повреждения фоторецепторов, вызванного светом. Фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), высвобождаемый поврежденными фоторецепторами, активирует глиальные клетки Мюллера, вызывая ядерную миграцию через внутренний и внешний ядерные слои для митоза и генерации нейрональных предшественников. Полученные изображения показывают динамику ядерной миграции и дифференцировки предшественников во время регенерации сетчатки.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Многофотонная микроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты, выполненные в данной рукописи, были оптимизированы для многофотонного микроскопа, оснащенного инфракрасным лазером (см. Таблицу материалов), объективом для погружения в воду с 40-кратным увеличением Apo (N.A. 1.15), гальванометрическим сканером и климатической камерой, содержащей вставку для четырех 35-мм чашек Петри. Изображения были получены с помощью детектора без сканирования (R-NDD).

1. Перед получением изображения уравновесьте климатическую камеру для достижения 5%_CO2 на атмосферу. Убедитесь, что в держатель вставлены пустые чашки Петри, чтобы избежать утечки газа в помещение.
2. Включите систему микроскопии.
3. После того, как климатическая камера будет уравновешена, добавьте жидкость с показателем преломления на объектив для погружения в воду на дальние расстояния 40X Apo (N.A. 1.15).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкость с показателем преломления с оптическими свойствами, аналогичными воде, используется для предотвращения испарения воды во время длительной визуализации.
4. Поместите в камеру флюоротары с эксплантами сетчатки. Используя светлый свет, расположите образец на световом пути и переместите среднюю область дорсальной сетчатки в плоскость фокуса.
5. Используйте эпифлуоресцентный свет GFP, чтобы сфокусироваться на gfap:nGFP-положительных ядрах глии Мюллера (Рисунок 1A, C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если экспланты не установлены плоско или под эксплантом скопилась агароза, будет трудно сфокусироваться на gfap:nGFP-положительных ядрах, иначе они будут тускло флуоресцировать.
   1. Проверьте, поможет ли перемещение в другую область в пределах одного и того же экспланта сетчатки решить проблему фокусировки. В противном случае перейдите к другому экспланту сетчатки.
6. В программном обеспечении для получения изображений откройте окна «A1 MP GUI», «TiPad», «A1 Compact GUI» и «ND acquisition». Для многофотонной визуализации убедитесь, что в графическом интерфейсе A1 Compact выбран параметр «IR NDD».
7. В поле «настройка» выберите IR-DM для 1-го дихроичного зеркала и выберите полосовой фильтр 525/50 для получения флуоресценции GFP.
8. Включите ИК-лазер в окне с надписью «A1MP GUI». Потребуется несколько минут, чтобы лазер был готов. Установите длину волны на 910 нм для возбуждения флуоресценции GFP и выровняйте лазер, нажав кнопку «Автоюстировка» в окне «A1 MP GUI».
9. Убедитесь, что освещение комнаты и оборудования выключено или закрыто, прежде чем открывать затвор в графическом интерфейсе A1 MP, чтобы избежать передержки фотоумножителя. Чтобы снизить уровень шума, размещайте микроскоп в затемненном помещении.
10. Получение изображений с полем зрения 300 x 300 пикселей при увеличении в два раза и времени пребывания пикселя 4,8 μс/пиксель. Грубо настройте мощность лазера, изменив «область захвата» в «A1MP GUI» и усиление в окне «A1 Compact GUI».
11. Настройка z-стека
    1. Сосредоточьтесь на слое ганглиозных клеток (GCL), чтобы установить верхнюю фокальную плоскость z-стека в подокне 'z' в окне 'ND acquisition'. Некоторые gfap:nGFP-положительные клетки обычно расположены в слое ганглиозных клеток, что помогает определить базальную границу сетчатки (рис. 1A, D).
    2. Переместите фокальную плоскость по уровню внешнего ядерного слоя (ONL) (рис. 1A, B), который характеризуется наличием тускло помеченных gfap:nGFP-положительных клеток, которые имеют круглую форму и увеличены по сравнению со своими аналогами во внутреннем ядерном слое (INL) (рис. 1A, C).
    3. Установите эту плоскость в качестве нижней части z-стека. Убедитесь, что будет отображен весь ONL (рис. 1A, B).
    4. При возникновении сдвигов в фокальной плоскости, которые требуют повторной настройки в течение периода съемки, дважды щелкните среднюю позицию в подокне «z», чтобы назначить ее «домашней» позицией. Перейдите на «симметричный режим определен» и нажмите «относительный».
    5. Установите размер z-шага в диапазоне от 0,7 до 1 мкм.
12. Коррекция Z-интенсивности:
    1. Примените коррекцию z-интенсивности, чтобы компенсировать потерю интенсивности пикселей из-за рассеяния света при визуализации в глубоких слоях ткани.
    2. Чтобы настроить коррекцию, откройте окно «Коррекция z-интенсивности». Чтобы установить 'z-stack range', выберите 'From ND'.
    3. Нажмите на нижнюю фокальную плоскость в окне 'коррекция z-интенсивности' (в данном случае соответствует слою ганглиозных клеток) и установите интенсивность лазера ("область захвата" в 'A1MP GUI') и усиление (A1 Compact GUI).
    4. Нажмите стрелку рядом с «z-значениями» в окне «Коррекция z-интенсивности», чтобы подтвердить настройки, которые впоследствии отображаются в разделе «Настройки устройства» в окне «Коррекция z-интенсивности» для выбранной фокальной плоскости.
    5. Повторите процесс для средней и верхней плоскостей, увеличивая мощность лазера и усиление. При необходимости могут быть добавлены дополнительные фокальные плоскости. В таблице 1 приведены конкретные настройки лазера и усиления для экспериментов на рисунках 1 - 3.
    6. Установите 'область захвата' в окне 'A1 MP GUI'. Избегайте выбора области регистрации больше 15 и усиления выше 126 в начале визуализации, чтобы избежать фотообесцвечивания и повышенного уровня шума.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку лазеры и фотоумножители различаются в разных системах микроскопии, проверьте настройки лазера и усиления, чтобы получить оптимальные условия визуализации для микроскопа, избегая при этом фотообесцвечивания.
    7. Выберите «Коррекция относительной интенсивности» в окне «Коррекция z-интенсивности».
13. В подокне "Таймсерии" в окне "Захват ND" установите продолжительность на 8 часов, а интервал на "без задержки". Затем обязательно нажмите «Запустить z-коррекцию» в подокне «z-stack» в окне «Получение ND», чтобы получить 3-D таймряды.
14. Поддерживайте температуру эксплантов сетчатки при температуре 27 - 29 °C на протяжении всего времени получения изображения.
15. В течение всего периода получения изображения, при необходимости, регулируйте уровень мощности и усиления, чтобы сохранить качество изображения для анализа после получения изображений. Для корректировки выполните шаги 1.11.2 - 1.11.4.
16. Если фокальная плоскость смещается, сделайте паузу или остановите прогон и повторите шаг 1.11.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если на шаге 1.12.7 была выбрана «относительная z-коррекция» и был выполнен шаг 1.11.4, то не должно быть необходимости в повторной настройке уровней мощности и усиления, если только не произошло обширное фотообесцвечивание.

Таблица 1: Лазер и уровни усиления, используемые для коррекции Z-интенсивности в различных плоскостях для экспериментов, показаны на рисунках 1 - 3.

	Tg[gfap:EGFP]nt11		Tg[rho:Eco.NfsB-EGFP]nt19
	Мощность лазера	Усиление	Мощность лазера
Усиление Верх (палочка, фоторецептор)	13	126	3,5	118
Средний (глия Мюллера)	10	126	2,8	118
Низ (слой ганглиозных клеток)	8	126	2,1	118

Результаты

Рисунок 1: 3-D реконструкция многофотонных стеков сетчатки Z. A) 3-D реконструкция многофотонной серии изображений z-стека gfap:nGFP-% положительных клеток в культурах сетчатки цельного крепления от рыбок данио через 48 часов после свет...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Флюорные приборы	Мировые прецизионные приборы	FD35-100	}
Стереомикроскоп	Nikon	SMZZzz-1B	Подойдет стереомикроскоп аналогичного типа
Люминесцентные лампы Sylvania OSFP5835HOECO	Bulbtronics	31850
Показатель преломления жидкость	Лаборатория Каргилла	1803Y
Многофотонный микроскоп Nikon A1, оснащенный инфракрасным лазером MaiTai	Nikon		}Эквивалентная система будет работать
40x Apo для дальней погружения в воду (N.A. 1.15) климатическая камера, оснащенная климатической камерой вставка для 35 мм петридиш	Околаб		Эквивалентная система будет работать
}Программное обеспечение для анализа NIS	Nikon		}

{{}}{{}}