Визуализация повреждения головного мозга, вызванного гипоксией-ишемией головного мозга, на мышиной модели

Аннотация

Источник: Ouyang, Y., et al. Одновременная визуализация ПЭТ/МРТ во время гипоксии-ишемии головного мозга мышей. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует метод оценки повреждения гипоксии головного мозга с помощью одновременной позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) и магнитно-резонансной томографии (МРТ). Мышь под наркозом подвергается перевязке общей сонной артерии (ОСА), что снижает приток крови к одному полушарию мозга и предрасполагает к травмам, вызванным гипоксией. ПЭТ и МРТ оценивают метаболизм глюкозы и структурные изменения во время гипоксии. МРТ обнаруживает ограниченную диффузию воды, в то время как ПЭТ показывает снижение поглощения глюкозы, что указывает на вызванный гипоксией клеточный стресс и метаболические нарушения.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Одностороннее лигирование общей сонной артерии (ОСА):

1. Подготовьте стерильное поле с помощью стерилизованных хирургических инструментов и материалов, удобно расположенных. Убедитесь, что грелка нагрета до 37 °C, а температурный щуп надежно закреплен на ней. Обязательно используйте стерильную простыню, чтобы закрыть место операции.
2. Обезболить животное (изофлуран, 1-3% на воздухе со скоростью 0,5-1 л/мин) и поместить животное в лежачее положение хвостом в сторону. Проверьте обезболивание, зажав палец ноги – это не должно вызвать никакой реакции, если животное правильно обезболили. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза.
3. Нанесите крем для депиляции на нижнюю часть шеи в верхнюю часть груди с помощью 1-2 ватных тампонов. Подождите 1-3 минуты, а затем удалите волосы и крем с помощью влажной марли или спиртовых тампонов. Мазок из области разреза Бетадином круговым способом изнутри наружу, а затем переодеться в стерильные хирургические перчатки.
4. С помощью хирургических ножниц сделайте разрез примерно на 1 см по средней линии нижней части шеи. Аккуратно отделите внешнюю кожу от окружающей фасции с помощью хирургических ножниц.
5. С помощью двух щипцов McPherson для наложения швов на микрорадужную оболочку отделите правую общую сонную артерию от фасции, стараясь не повредить вены или не потревожить блуждающий нерв.
6. С помощью щипцов справа выведите правый ОСА в устойчивое положение. Нанесите несколько капель физраствора, чтобы предотвратить высыхание. Проденьте шелковый шов подходящей длины (2-3 см) 6-0 под правый CCA и завяжите двойным квадратным узлом. По желанию снова перелинтируйте с использованием второго отрезка шелкового шва 6-0.
7. Переместите правый CCA и удалите лишнюю жидкость из отверстия с помощью стерильного тампона с губкой. Закройте разрез шелковым швом 6-0. Применять лидокаин местно в дозе до 7 мг/кг.
8. Дайте животному восстановиться после анестезии до амбулаторного состояния (примерно 30 минут) и проводите послеоперационное наблюдение до тех пор, пока животное не будет готово к визуализации.

2. Подготовка к визуализации: проверка системы и оборудования

1. Настройте аппаратное и программное обеспечение для систем МРТ и ПЭТ и проверьте их функциональность следующим образом. Убедитесь, что все физические соединения безопасны, а настройки программного обеспечения выбраны правильно.
   1. Убедитесь, что система ПЭТ имеет предписанную рабочую температуру 5 °C, используя систему воздушного охлаждения.
   2. Установите систему ПЭТ внутри отверстия МРТ, совместив центры поля зрения ПЭТ и МРТ с использованием известных осевых смещений. Установите катушку МРТ внутрь отверстия системы ПЭТ и центрируйте катушку с помощью магнитных центров системы ПЭТ и МРТ.
   3. Включите электронику ПЭТ для измерения мощности и напряжения смещения (примечание: шаги зависят от прибора). Выполните быстрое (5 минут) сканирование с помощью цилиндра 68Ge и проверьте полученную синограмму, чтобы убедиться, что все детекторы работают.
   4. При необходимости получить данные, которые будут использоваться для матрицы преобразования ПЭТ/МРТ в целях совместной регистрации: заполните трехмерный фантом (например, три заполненные сферы) 200 μCi водного раствора 18F и получите данные в течение 15 минут с помощью ПЭТ. Получение анатомических данных МРТ: в окне управления сканированием выберите многосрезовую мультиэхокардиографическую последовательность (ММСП) (см. Таблицу 1). Повторите для всех трех основных ориентаций: осевой, сагиттальной и корональной.
2. Проверьте настройки и работу инфузионного насоса. Установите насос на 4,44 μл в минуту, что за 45 минут постоянной инфузии подает общий объем 200 μл, что является типичным рекомендуемым пределом для внутривенного (в/в) введения животному массой 20 г.
3. Проверьте работу нагревателя и убедитесь, что выходная температура достаточна для поддержания тепла животного (37 °C). Убедитесь, что мониторинг температуры и дыхания функционирует, чтобы подготовиться к размещению животного на кровати для животных.
4. Проверьте работу расходомеров O2 и N2 (для 0,5 л/мин: O2 при 57,2 мг/мин и N2 при 0,575 г/мин), включив оба источника при выключенном источнике сжатого воздуха и включенных источниках O2 и N2. Во избежание риска повреждения расходомеров не включайте их без достаточного входного давления.
5. Убедитесь, что испаритель изофлурана достаточно заполнен. Перед визуализацией начните изофлурановую анестезию с 1-2% и от 0,5 до 1 л/мин.
6. Подготовьте лежанку для животных, убедившись, что анестезия, дыхательная подушка и системы обогрева надежно расположены и функционируют. Для повышения точности совместной регистрации ПЭТ/МРТ реперные знаки (например, капиллярные трубки, заполненные радиоактивным индикатором в той же концентрации, что и при введении для визуализации) могут быть прикреплены к ложу животного в пределах поля зрения.

3. Процесс визуализации

После завершения всех необходимых проверок оборудования приступайте к визуализации следующим образом:

1. Обезболите животное изофлураном и вставьте катетер хвостовой вены (игла 28 G, трубка PE-10 менее 5 см), заполненный гепаринизированным физиологическим раствором (0,5 мл гепарина, 1 000 USP/мл, в 10 мл физиологического раствора). Согревание животного и/или хвоста может повысить точность введения катетера. По желанию поместите каплю цианоакрилатного клея на место введения, чтобы закрепить капельницу внутривенного введения.
2. Переложите животное на подготовленную подстилку для животных. Убедитесь, что голова животного надежно закреплена, а верхние резцы закреплены зубным стержнем, а ушные уши, если они используются, закреплены.
3. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить высыхание. Вставьте ректальный зонд термометра. Убедитесь, что показания температуры и дыхания работоспособны.
4. Наберите дозу радиоактивного индикатора (около 600 μКи на 200 μл) для введения в гепаринизированную трубку PE-10 соответствующей длины – примерно 3 м для трубки PE-10 и объемом 200 μл. Подсоедините один конец этой трубки к шприцу инфузионного насоса, а другой – к катетерной линии хвостовой вены, Соблюдая осторожность, чтобы не образовались проколы в трубке.
5. Сдвиньте кровать животного вперед в отверстие магнита, следя за тем, чтобы не нарушить расположение катушки МРТ и любых линий или кабелей, особенно трубки для анестезии. Убедитесь, что центр мозга выровнен с центрами катушки МРТ, ПЭТ-системы и магнита МРТ.
6. Выполните настройку и согласование катушки МРТ, вращая ручки регулировки на катушке, минимизируя несоответствие импеданса (проверьте характеристики катушки) и частоты (300 МГц для 1 часа при 7 Тесла) путем наблюдения за дисплеем мощного предусилителя.
7. (МРТ) После настройки и сопоставления получите скаут-изображение: выберите последовательность трипилота Rapid Imaging with Refocused Echoes (RARE) и запустите последовательность из окна управления сканированием. Проверьте положение животного, при необходимости повторяя шаги 3.5 и 3.6. Сбросьте прокладки в нулевое значение.
8. (МРТ) Получите локализованное спектроскопическое сканирование с точечным разрешением (PRESS) в объеме мозга: Запустите последовательность PRESS (см. Таблицу 1) в прямоугольном объеме размером 3,9 мм × 6 мм × 9 мм. Проверьте ширину ватерлинии с помощью макрокоманды CalcLineWidth. Если значение полной ширины при полумаксимальном значении (FWHM) приемлемо (например, 0,2 ppm), перейдите к шагу 3.10. Если нет, перейдите к шагу 3.9.
9. (MRI) Получение карты поля: Запустите последовательность FieldMap (см. Таблицу 1). Полученные данные можно использовать для создания прокладки многоугловой проекции (MAPSHIM), выполнив макрокоманду MAPHIM и выбрав линейную локальную корректировку и корректировку второго порядка (z2). Повторите шаг 3.8.
10. (МРТ) Расположите план среза для сканирования с помощью диффузионно-взвешенной визуализации (DWI) (см. Таблицу 1): с помощью редактора геометрии убедитесь, что поле зрения сбора данных расположено таким образом, чтобы получить желаемый интересующий объем в мозге. Если полученный план среза выровнен по желанию, скопируйте этот план среза в окне управления сканированием для всех последующих сканирований DWI. Начните приобретение.
11. (ПЭТ) Когда приобретение ПЭТ подготовлено и готово к началу, запустите инфузионный насос. После заранее определенной задержки, с которой был введен физиологический раствор из катетера, начните сбор данных ПЭТ (см. Таблицу 1) для захвата радиоактивного индикатора. Следите за скоростью подсчета и ищите постепенное увеличение количества, указывающее на успешную инъекцию.
12. Через 10-15 минут начните гипоксическую провокацию одновременно с шагом 3.12. Чтобы инициировать гипоксическую продукцию, выключите поток медицинского воздуха и немедленно включите расходомеры O2 и N2 с заранее определенными настройками для подачи 8% кислорода и 92% азота, а также уменьшите изофлуран до 0,8%. Не включайте расходомеры без входного давления.
13. (МРТ) Одновременно с шагом 3.12 начните сбор данных DWI, подготовленный на шаге 3.10 (сканирование «H1»).
14. (МРТ) Начните сбор данных DWI (сканирование «H2»), подготовленное на шаге 3.10, сразу после завершения сканирования H1. Устраните гипоксическую проблему, отключив флоуметры, восстановив поток медицинского воздуха и вернув концентрацию изофлурана к приемлемому значению на основе физиологического мониторинга.
15. (МРТ) Проведите сканирование DWI после гипоксии, подготовленное на шаге 3.10. Выключите инфузионный насос после завершения сканирования.
16. (МРТ) Получение анатомических изображений в осевой и сагиттальной плоскостях. В окне «Управление сканированием» выберите последовательность ММСП (см. таблицу 1). С помощью редактора геометрии убедитесь, что поле зрения захвата охватывает мозг.
17. Уберите животное, верните его в клетку во время амбулаторного лечения и следите за признаками заболеваемости, при необходимости усыпьте с введением СО2 с последующим вывихом шейки матки в качестве вторичного метода.

Таблица 1. Параметры последовательности импульсов МРТ для сканирования, описанные в протоколе, а также параметры сбора ПЭТ, гистограммы и реконструкции.

Параметры получения изображений и аппаратный сбор
Диффузия МРТ (EPI-DWI)
Время получения	15 мин
Размер матрицы	256 x 64
Срезы	10
FOV	30 x 14 x 8 мм
Размер вокселя	0,117 x 0,219 x 0,8 мм
Эффективная спектральная полоса пропускания	150 кГц
TE	41 мсек
TR	3,000 мсек
Усреднение	6
k-сегментов пространства	16
b-значений	0, 400, 800 сек/мм2
Анатомическая МРТ (ММСП)
Время сбора данных	5 мин
Размер матрицы	256 x 256
Срезы	16
FOV	30 x 22 x 12,8 мм
Размер вокселя	0,117 x 0,086 x 0,8 мм
TE	14 мсек
TR	1 000 мсек
Среднее	1
повторение	1
Спектроскопическое сканирование с точечным разрешением (PRESS)
Время захвата	15 с
Размер вокселя	3,9 x 6 x 9 мм
TE	20 мсек
TR	2,500 мсек
Среднее значение	6
FieldMap
Время захвата	1 мин 21 сек
1-й TE	1,49 мс
2-й TE	5,49 мсек
TR	20 мсек
Средние значения	1
Получение ПЭТ, гистограмма, и параметры реконструкции
Tracer	[18F]FDG
Скорость инфузии	4,44 μл/мин
Время захвата	60 мин
Размер изображения на срез	128 x 128
Срезов	99
Размер вокселя	0,4 x 0,4 x 0,6 мм
Динамическое кадрирование	12 x 300 сек
Тип реконструкции	OS-MLEM (6 подмножеств, 6 итераций)

данных значение

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Хирургия
Хирургические ножницы	Roboz	RS-5852
Щипцы	Roboz	RS-5237
Щипцы от комаров Hartman	Miltex	7-26
2x Щипцы для наложения швов McPherson, 8,5 см	Accurate Surgical & Scientific Instruments	4473	Полезно уменьшить ширину отверстия с помощью ленты на щипцах, используемых для удержания сонной артерии
6-0 Плетеный шелковый шов с силиконовым покрытием с иглой 3/8 C-1	Covidien Sofsilk	S-1172
Система гомеотермического одеяла	Harvard Apparatus	507220F
Super клей	(общий)
гипоксии
для O₂	Alicat Scientific	MC-500SCCM-D
флометр для N₂	Alicat Scientific	MC-5SLPM-D
O₂ метр	MSA	Altair Pro
Imaging
Система МРТ 7,05 Тесла	Bruker	BioSpec	внутренний диаметр отверстия 20 см с градиентным набором. Программное обеспечение Paravision 5.1.
Объем катушки Tx/Rx 1H, система ПЭТ Bruker		T8100
	(в)		4x24 детектора LSO-PSAPD,
массив LSO 10x10 на детектор,
шаг кристаллов 1,2 мм и глубина 14 мм. PSAPD 14 x 14 мм. Угол обзора: 60x35 мм. Энергетическое окно 350-650 кэВ. Временное окно 16 нс.
Канюляция сосудов Щипцы Dumont	Roboz	RS-4991
PE-10 полиэтиленовые трубки	BD Intramedic	427401
Инфузионный насос	Braintree Scientific	BS-300
Оборудование для мониторинга животных и литникования	Small Animal Instruments Inc.	Модель 1025	Используется только мониторинг дыхания
Кровать для животных с регулировкой температуры	(In-house)

расходомер ID 35 мм