Покадровая визуализация трансфицированных первичных клеток коры головного мозга мыши

Аннотация

Источник: Landeira, B. S.,et al., Живая визуализация первичных клеток коры головного мозга с использованием 2D-системы культивирования. J. Vis. Exp. (2017)

Видео демонстрирует использование покадровой визуализации для отслеживания флуоресцентно меченных корковых предшественников, мониторинга их деления и дифференцировки, а также изучения развития линий в первичных клетках коры головного мозга

Протокол

1. Покадровая видеомикроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага требуется инвертированный флуоресцентный микроскоп с инкубационной камерой (см. Таблица материалов).

1. После заражения ретровирусом поместите планшет для культивирования тканей в инкубатор, подключенный к контроллерам температуры и CO₂.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительный нагрев камеры в течение 3 часов перед началом съемки может помочь свести к минимуму дрейф и расфокусировку во время съемки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Камера должна поддерживать ячейки в постоянных условиях 37 °C и 5% CO₂.
2. Выберите положение на оси XY, которое будет служить нулевой точкой (XY = 0). Это позволит справочнику снова найти позиции в будущем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется нарисовать на табличке знак, который можно использовать в качестве ориентира для определения нулевой точки.
3. Выберите позиции для отображения с 10-кратным увеличением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите 10-15 позиций для каждой лунки, чтобы увеличить вероятность наблюдения ретровирусно-трансфицированных клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объективы с большим увеличением на большом расстоянии (20X или 40X) могут быть использованы для получения изображений с более высоким разрешением. В зависимости от рабочего расстояния объективов могут потребоваться пластины со стеклянным дном.
4. Получайте фазово-контрастные изображения каждые 5 минут и флуоресцентные изображения каждые 3 часа для снижения фототоксичности. Проверьте и отрегулируйте фокус в первые 3 часа эксперимента, так как он может измениться, пока температура уравновешивается. Ежедневно проверяйте и корректируйте фокусировку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы видим, что фокус становится стабильным после первых 24 часов. Тем не менее, желательно следить за фокусировкой. В качестве альтернативы можно использовать программную систему автофокусировки.
5. Через 7 дней прекратите приобретение.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ImageJ	NIH
tTt	ETH Zurich	}
}Микроскоп наблюдателя клетки	Zeiss
Программное обеспечение Tracking Tool (tTt)		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html