Визуализация ex vivo постнатальной миграции гранулярных клеток мозжечка с помощью конфокальной макроскопии

Аннотация

Источник: Bénard, M., et al. ex vivo Визуализация постнатальной миграции гранулярных клеток мозжечка с помощью конфокальной макроскопии. J. Vis. Exp. (2015)

}Это видео демонстрирует конфокальный макроскопический метод отслеживания миграции ex vivo миграции гранулярных клеток в срезах мозжечка из постнатального мозга крыс.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Флуоресцентное окрашивание живых интернейронов

1. Перенесите ломтики мозжечка с помощью стеклянной усеченной пастеровской пипетки с широким отверстием на 6-луночный планшет (максимум 3 среза/на лунку). Отсасывайте среду со сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS).

2. Инкубируйте срезы (не более 3) в 5 мл загрузочного раствора флуоресцентного красителя (10 мкМ).

3. Для защиты от света накройте микропластину алюминиевой фольгой. Поместите его на гироскопический стол при 35 об/мин на 10 минут при RT, чтобы облегчить маркировку клеток.

4. Перенесите срезы на мембрану вкладыша Transwell (размер пор 3,0 мкм; Рисунок 1D) с широким отверстием стеклянной усеченной пастеровской пипеткой. Отсасывайте загружаемую среду с помощью пипетки.

5. Снимите вкладыш и заполните лунку 1,9 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle Medium (DMEM). Установите вставку на место и добавьте 100 мкл DMEM поверх среза, чтобы покрыть ткань.

6. Поместите планшет с культуральными вкладышами в камеру инкубатора (37 °C, 5% CO₂) на 2 часа, достаточный для наблюдения гранулярных клеток (GC) в молекулярном слое (ML). Положите ткани на плоскую поверхность, чтобы обеспечить прикрепление к мембране вставки (Рисунок 1E). Следите за тем, чтобы ломтики не высыхали.

2. Ex vivo Визуализация с помощью конфокальной макроскопии

1. Перенесите планшет без пластиковой крышки в инкубатор, прикрепленный к подставке с конфокальным макроскопом. Поместите стеклянную крышку на пластину-вкладыш макроскопа. Поддерживайте температуру камеры на уровне 37,0 °C ± 0,5 °C и подавайте на ломтики постоянный поток газа (95% O₂, 5% CO₂) через пластину-вкладыш для поддержания постоянного pH. Подождите еще 2 часа, прежде чем экспериментировать с интервальной съемкой.

2. Для визуализации миграции ГХ в срезах тканей необходимо с помощью лазерного диода с помощью лазерного диода осветить препарат с помощью конфокального лазерного сканирующего макроскопа, оснащенного сухим объективом X2 (рабочее расстояние: 39 мм, диаметр: 58 мм, NA = 0,234), и обнаружить флуоресцентное излучение в диапазоне от 500 до 530 нм.

1. Чтобы точно разрешить движение ГХ, получите изображения с дополнительным коэффициентом оптического зума от 1,5 до 2,0. Собирайте изображения ГХ в одной фокальной плоскости или до 10 различных фокальных плоскостей вдоль оси z каждые 30 минут в течение 12 часов.

3. При необходимости снимите стеклянную крышку и добавьте небольшие объемы (1-10 мкл) биологических активаторов или ингибиторов в DMEM с помощью пипетки объемом 10 мкл, чтобы изучить их влияние на миграцию GC.

3. Отслеживание клеток

1. Для каждого момента просмотра фильма выполните проекцию z-стека в режиме типа ecart в ImageJ. Модулируйте уровни контрастности и яркости последовательных изображений, чтобы облегчить идентификацию и отслеживание помеченных GC. Вручную нанесите на карту каждое положение на эталонном снимке (при t = 0).

1. Используйте плагин "Ручное отслеживание" в меню "Анализ частиц" и определите, нажав на точку гравитации каждого тела клетки во время таймлапса. Экспортируйте необработанные данные отслеживания в таблицу.

2. Реорганизуйте экспортированные необработанные данные отслеживания из ImageJ с помощью умной домашней программы, которая идентифицирует каждую ячейку и связанные с ней позиции. С помощью программы рассчитайте общее пройденное расстояние и среднюю скорость миграции для каждой клетки. Классифицируйте и сравнивайте характеристики миграции клеток в контрольных и лечебных условиях под соответствующими фильтрами с помощью одной и той же программы.

Результаты

Рисунок 1: Ex vivo культура срезов мозжечка P10. (A) Вскрытый мозжечок у крысы Р10. Масштабная линейка = 6 мм. (B) Микрофотография живого среза мозжечка толщиной 180 мк...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модифицированная смесь питательных веществ Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) F-12	Sigma-Aldrich	D8437
Cell Tracker Green CMFDA	Invitrogen	C2925
Вставки из полиэстера Transwell-Clear	Corning	3452
6-луночная клеточная культура cluster	Corning	3516
DMSO	}Fisher Scientific	BP231-100
Gyro-rocker, SSL3	}Stuart
CO₂ инкубатор, Hera Cell 150	Thermo Scientific
}Конфокальный макроскоп, TCS LSI	Leica Microsystems
CO₂-контроллер	PeCon	}
} Сбалансированный раствор соли Хэнка 10x	Sigma-Aldrich	H1641
Дозатор с регулируемым объемом (0.0.13} 5-10μL)	Eppendorf	4910 000.018
Регулятор температуры	PeCon

}{{}}