Покадровая визуализация деления нервных стволовых клеток мыши с помощью конфокальной микроскопии

Аннотация

Источник: Daynac, M., et. al. Сортировка нейронных стволовых и прогениторных клеток из субвентрикулярной зоны взрослой мыши и живая визуализация динамики их клеточного цикла. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует покадровую визуализацию нейронных стволовых клеток (НСК) из трансгенного мозга мыши с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа. НСК флуоресцируют красным цветом во время фазы G1 и не флуоресцентны в других фазах клеточного цикла. Адгезивный культура NSC помещается в камеру визуализации, устанавливаются параметры визуализации, и изображения захватываются через равные промежутки времени в течение желаемой продолжительности.

Протокол

1. Базовая настройка перед посевом и видеомикроскопией

1. Используйте планшеты со стеклянным дном или μ-планшеты для конфокальной видеомикроскопии. Для 1 - 5 x 10³ ячеек/лунки используйте 96-луночные планшеты, а для более чем 5 x 10³ клеток/лунки используйте 24-луночные планшеты.
2. По крайней мере за один день до начала эксперимента приготовьте стерильные планшеты, покрытые поли-D-лизином (PDL) для адгезивных монослойных культур. Добавьте достаточное количество PDL (10 мкг/мл в дистиллированной воде или dH₂O), чтобы покрыть дно каждой лунки, и инкубируйте в течение ночи (O/N) при 37 °C. Удалите раствор PDL и трижды промойте dH₂O, прежде чем дать пластине высохнуть в колпаке в течение не менее 2 часов под ламинарным потоком. Если планшет с покрытием не используется сразу, храните его при температуре -20 °C.
3. Приготовьте питательную среду, смешав базальную среду нейральных стволовых клеток (НСК) и добавку пролиферации НСК в соотношении 9:1 (см. таблицу материалов) вместе с 2 мкг/мл гепарина, 20 нг/мл очищенного человеческого рекомбинантного эпидермального фактора роста (EGF), и 10 нг/мл человеческого рекомбинантного фактора роста фибробластов 2 (FGF-2). Перед применением прогрейте питательную среду до 37 °С на водяной бане.
4. Для диссоциации субвентрикулярной зоны (СВЗ) готовят раствор папаина: 1 мг/мл папаина (15 UI/мл) в солевом растворе Earl's Balance Salt Solution (EBSS), содержащем 0,2 мг/мл L-цистеина, 0,2 мг/мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,01 мг/мл ДНКазы I в фосфатно-солевом буфере (PBS). Стерилизуйте раствор, пропустив его через фильтр 0,2 мкм. Перед использованием сбалансируйте раствор при температуре 37 °C.
5. Чтобы остановить ферментативную реакцию, готовят раствор ингибитора протеазы (овомукоид): модифицированную орлиную среду дульбекко (DMEM): среду F12, содержащую 0,7 мг/мл ингибитора трипсина типа II. Отфильтруйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм.
6. Приготовьте 0,6% раствор глюкозы PBS для сбора мозгов и 0,15% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) PBS для промывания и окрашивания антителами.
7. Подготовьте инструменты для препарирования: ножницы, щипцы для рассечения и завязывания, а также скальпель. Замочите их в 70% этаноле.

2. Забор мозга взрослых мышей и микродиссекция SVZ

1. Пожертвование взрослых мышей с флуоресцентным убиквитинированием клеточного цикла (FUCCI) (в возрасте от 2 до 3 месяцев и/или 12 месяцев для исследований старения), выполнение вывиха шейки матки в соответствии с соответствующими институциональными рекомендациями.
2. Сбрызните мышь 70% этанолом и отрежьте голову острыми ножницами.
3. Сделайте разрез вдоль кожи головы, чтобы обнажить череп.
4. Выполните продольный разрез по средней линии, начиная от основания черепа по направлению к обонятельным луковицам, с помощью небольших ножниц. Следите за тем, чтобы не повредить подлежащий мозг лезвиями ножниц. Удалите верхнюю открытую часть черепа с помощью изогнутых щипцов, чтобы обнажить мозг.
5. Соберите мозг в 15-миллиметровую чашку Петри, содержащую 0,6% глюкозы в PBS.
6. Рассеките обонятельные луковицы. Поместите мозг на его дорсальную поверхность и сделайте корональный разрез через зрительный хиазму с помощью скальпеля.
7. Под рассекающим микроскопом расположите ростральную часть участка мозга так, чтобы поверхность разреза короны была обращена вверх к экспериментатору.
8. Чтобы рассечь СВЗ, удалите перегородку с помощью тонких изогнутых щипцов, затем введите один кончик тонкого щипца в полосатое тело, непосредственно прилегающее к желудочку, и отделите СВЗ от окружающих тканей. Препарированный СВЗ поместите в чашку Петри, содержащую 1 мл PBS-0,6% глюкозы.

3. Диссоциация тканей СВЗ

1. Измельчите рассеченный СВЗ в чашке Петри, пока не останутся крупные куски.
2. Переложите измельченную салфетку вместе с PBS-0,6% глюкозой в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 200 x g в течение 5 мин.
3. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 1 мл предварительно подогретого папаина (1 мг/мл, приготовленного на шаге 1.4) с добавлением 0,01 мг/мл ДНКазы I. Инкубируйте в течение 10 минут на водяной бане при 37 °C. Используйте 1 мл папаина на каждую мышь.
4. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
5. Добавьте 1 мл предварительно подогретого овомукоида (0,7 мг/мл, приготовленного на шаге 1.5) для остановки активности папаина. Механически диссоциируйте измельченную ткань дальше в одноклеточную суспензию, осторожно пипетируя вверх и вниз 20 раз через наконечник микропипетки p1000. Избегайте образования пузырьков воздуха.
6. Пропустите клеточную суспензию через стерильный фильтр 20 мкм в новой пробирке объемом 15 мл. Обязательно промойте фильтр ячеек PBS 0,15% BSA, чтобы избежать потери ячеек.
7. Центрифугируйте при 200 x g в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл PBS, содержащем 0,15% BSA.

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание для сортировки клеток

Для сортировки клеток с использованием мышей FUCCI-Red (Рисунок 1A) используйте следующие антитела: конъюгат CD24 фикоэритрин-цианин7 [PC7]; CD15/LeX флуоресцеин изотиоцианат [FITC] конъюгированный и конъюгированный Ax647 EGF лиганд.

Примечание: Клетки LeX⁺EGFR⁺} и клетки EGFR⁺} не в изобилии у взрослой особи SVZ: ≈ 600 и 1500 клеток на мышь соответственно. Мы рекомендуем объединять ячейки СВЗ от 2 до 3 мышей, чтобы было достаточно материала. Не работайте более чем с 12 мышами в один день, чтобы продолжительность сортировки клеток не превышала 3 часов. Имейте в виду, что работа со слишком большим количеством мышей в один и тот же день приведет к увеличению продолжительности сортировки клеток, что может привести к увеличению гибели клеток и/или дифференцировке клеток.

1. Для оптимального окрашивания проводите окрашивание методом FACS в 100 мкл PBS 0,15% BSA на мышь (или в 200 мкл для группы от 2 до 3 мышей).
2. Подготовьте контрольные трубки. Используйте компенсационные бусины для подготовки одноцветных контрольных трубок в соответствии с протоколом производителя. Выберите фракцию клеток (достаточно 1/10 клеток, извлеченных из одной мыши) и разделите ее на 4 пробирки, чтобы получить 1 отрицательную контрольную пробирку (немаркированные клетки) и 3 контрольные пробирки флуоресценции минус одна (FMO). Ресуспендируйте клетки в 200 мкл PBS 0,15% BSA на пробирку.
   Подсказка: Для контроля LeX-FITC FMO пометьте клетки CD24-PC7 (1:50) и Ax647‐конъюгированным лигандом EGF (1:200); Для контроля CD24-PC7 FMO пометьте клетки CD15/LeX-FITC (1:50) и Ax647-конъюгированным лигандом EGF (1:200), а для контроля Ax647-конъюгированного EGF лиганда FMO пометьте клетки CD15/LeX-FITC (1:50) и CD24-PC7 (1:50).
3. Для пробирок, используемых для сортировки клеток, используют следующие антитела в указанном разведении в PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (1:50), CD15/LeX-FITC (1:50) и Ax647-конъюгированный лиганд EGF (1:200).
4. Выдерживать 20 минут при температуре 4 °C в темноте. Вымыть 1 мл PBS 0,15% BSA и центрифугировать при 200 x g в течение 10 минут. Ресуспендируйте клетки в 200 мкл PBS 0,15% BSA на мозг. Держите пробирки для сортировки клеток на льду и сразу приступайте к сортировке клеток.
5. При использовании мышей FUCCI-Green разделите LeX-положительную и LeX-отрицательную фракции с помощью разделительных колонок перед сортировкой клеток, поскольку антитело LeX-FITC имеет ту же длину волны излучения, что и флуоресценция FUCCI-green (Рисунок 2A, B).
   1. Сначала пометьте клетки мышиным античеловеческим антителом LeX (1:50) в течение 15 минут при 4 °C в темноте в 100 мкл PBS 0,15% BSA.
   2. Промойте клетки 1 мл PBS 0,15% BSA и центрифугируйте при 200 x g в течение 10 минут, затем пометьте клетки микрогранулами IgM против мышей (1:10) в течение 15 минут при 4 °C в темноте.
   3. Промойте ячейки 1 мл PBS 0,15% BSA и центрифугируйте при 200 x g в течение 10 минут. Повторно суспендируйте элементы в 500 мкл PBS 0,15% BSA и вылейте элементы через разделительную колонку в магнитное поле, как показано на рисунке Рисунок 2C. Промойте колонку 1 мл PBS 0,15% BSA для получения отрицательной фракции LeX.
   4. Чтобы получить LeX-положительную фракцию, удалите разделительную колонку из магнитного поля и элюируйте клетки 2 мл PBS 0,15% BSA.
   5. Перейдите к окрашиванию CD24-PC7 и Ax647‐конъюгированным лигандом EGF, как указано в пункте 4.2.

5. Сортировка клеток

Примечание: Клетки сортировали на сортировщике FACS при давлении 40 фунтов на квадратный дюйм с соплом 86 мкм. Флуоресценция собиралась с помощью следующего набора фильтров: 520/35 нм (FITC), 575/26 нм (PE), 670/20 нм (Ax647) и 740LP (PC7). Компенсация необходима для предотвращения ложноположительных сигналов, так как обнаруживается перекрытие между спектрами излучения FUCCI-красной флуоресценции и красителя PC7.

1. Непосредственно перед сортировкой клеток добавьте жизненно важный краситель, чтобы отличить живые клетки от мертвых. Мы использовали Hoechst (HO) (см. таблицу материалов) в конечной концентрации 2 мкг/мл. Пропустите отрицательную контрольную трубку (немаркированные ячейки) через сортировщик FACS и выберите ячейки, используя параметры бокового рассеяния (SSC) и прямого рассеивания (FSC) (Рисунок 3A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мертвые клетки были исключены путем гейтирования только HO-отрицательной фракции (Рисунок 3A), а затем дублеты были исключены путем выбора отрицательной фракции Pulse Width (Рисунок 3A).
2. Запустите одноцветные регуляторы, подготовленные на шаге 4.2, и при необходимости отрегулируйте напряжение фотоумножителя (ФЭУ) (т.е. слишком высокое отрицательное заполнение и/или положительные ячейки за пределами масштаба). Выполните цветовую компенсацию в окне компенсации программного обеспечения.
3. Запустите элементы управления FMO, подготовленные на шаге 4.2 (управление LeX-FITC FMO, управление CD24-PC7 FMO и управление FMO с сопряженным лигандом EGF Ax647) и нарисуйте сортировочные ворота (Рисунок 3). Отсортируйте клетки непосредственно в 100 мкл питательной среды в микропробирках объемом 1,5 мл.

6. Подготовка клеток к микроскопии

1. Планшетируйте свежеотсортированные клетки с плотностью 1 - 3 x 10³ клеток/лунку на 96-луночном μ-планшете, покрытом поли-D-лизином, 300 μл питательной среды.
2. Перед видеомикроскопией инкубируйте культуральные планшеты при 37 °C и 5% CO₂ в течение не менее 1 часа, чтобы обеспечить адгезию клеток.

7. Настройка микроскопа и получение изображений

1. Выполняйте визуализацию в реальном времени с использованием объектива Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) на конфокальной лазерной сканирующей микроскопической системе, прикрепленной к инвертированной термостатированной камере при температуре 37 °C при атмосфере 5% CO₂.
2. Поместите 96-луночную μ-Plate в предварительно нагретую и уравновешенную термостатированную камеру и установите крышку на термостатированную крышку.
3. Откройте программное обеспечение NIS-Elements и нажмите в строке меню на «Захват/Управление захватом/Захват ND», чтобы выбрать параметры таймлапса (длина, положение сцены, конфокальные z-сечения,...), «Захват/Управление захватом/Ti Pad» для выбора объективов и «Захват/Управление захватом/A1plus Settings», чтобы выбрать уровень ФЭУ для каждой флуоресценции в строке меню. Выберите папку для сохранения файлов данных.
4. В окне сбора данных ND установите центр каждой лунки в качестве положения предметного столика и выберите вариант большого изображения 7 x 7 мм². Это создаст мозаичное изображение вокруг центра каждой лунки. Установите перекрытие для большого изображения мозаики на 5%. Делайте снимки каждые 20 минут в течение 24 часов. Выберите цель Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) в окне Ti Pad.
5. В окне настроек A1plus можно получить изображения с помощью высокоскоростного резонансного сканера в формате 512 x 512 пикселей с разрешением 1,26 мкм/пиксель. Используйте светлое поле для визуализации форм ячеек. В случае мышей FUCCI-Red возбуждают красную флуоресценцию на длине волны 561 нм и собирают с помощью фильтра 595/50 нм. В случае мышей FUCCI-Green возбуждайте зеленую флуоресценцию на длине волны 488 нм и собирайте с помощью фильтра 530/40 нм. Определение оптимального уровня, смещения и мощности лазера для каждой длины волны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать функцию автофокусировки для светлого канала, чтобы позволить программному обеспечению автоматически фокусироваться на каждой позиции сцены перед каждым захватом. Подсказка: Объектив Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) был использован из-за его превосходного разрешения без необходимости использования масла. В зависимости от желаемого оптического разрешения можно использовать и другие объективы.
6. Нажмите кнопку «Запустить сейчас» в окне сбора данных ND, чтобы начать сбор данных.

Результаты

Рисунок 1: Живой анализ клеточного цикла с использованием мышей FUCCI-Red. (A) Схематическое изображение клеточного цикла FUCCI-Red, где клетки являются красными флуоресцентными во время G₁ фаза и бесцветный во время фаз S-G_2...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
96-well непокрытое стекло дно культурные тарелки	MatTek Corp.	P96G-1.5-5-F
μ-пластины 96-луночный	ibidi	89626
Поли-D-лизин	Миллипор	A003E
NeuroCult NSC Базальная среда	STEMCELL Technologies	5700
NeuroCult NSC Пролиферационная добавка	STEMCELL Technologies	5701
Гепарин	СТВОЛОВАЯ КЛЕТКА Технологии	7980
EGF	Millipore	GF144
FGF-2	Millipore	GF003
Papain	Worthington	LS003119
EBSS	Invitrogen	24010-043
L-цистеин	Sigma	C-7352
0,5M EDTA, pH 8,0	Promega	V4231
ДНКаза	I Sigma	D5025-15KU
Ингибитор трипсина типа II	Sigma	T9128	Овомукоид
DMEM:F12 medium	Life Technologies	31330-038
20 мкм фильтр	BD Medimachine Filcon	340622
микротрубки Eppendorf 3810X	Sigma	Z606340-1000EA
BSA	Sigma	A1595	Сывороточный альбумин крупного рогатого скота
CD24 фикоэритрин-цианин7 конъюгат [PC7]	Life Technologies	A14776	Мышиный IgM; клон MMA. 1:50
CD15/LeX флуоресцеин изотиоцианат [FITC] - конъюгированный	BD Biosciences	332778	крысы IgG2b; клон M1/69. 1:50
Мышиный античеловеческий антитело LeX	BD Pharmingen	559045	Мышь IgM; клон MAM. 1:50
Alexa647 - сопряженный лиганд EGF	Life Technologies	E35351	1:200; Ax647-конъюгированный лиганд EGF
CompBeads	BD Biosciences	644204
MACS LS разделительные колонки	Miltenyi Biotec	130-042-401	Разделительные колонки
Anti-mouse IgM микрогранулы	Miltenyi Biotec	130-047-301
Hoechst 33258	Sigma	861405
INFLUX сортировщик клеток	BD Biosciences		FACS-сортировщик
Nikon A1R конфокальная лазерная сканирующая микроскопическая система, прикрепленная к перевернутому ECLIPSE Ti	компании Nikon Corp.		Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп
NIS-Elements AR.4.13.01 64-битное программное обеспечение	Nikon Corp.		Программное обеспечение NIS-Elements
Plan Apo VC 20x DIC объектив (NA: 0.75)	Nikon Corp.
Термостатированная камера ECLIPSE Ti	Nikon Corp.		Термостатированная камера
ImageJ	RBS
FlowJo	Tree Star, Ашленд, OR
мыши FUCCI	RIKEN BioResource Center, ЯПОНИЯ

от