Микроэндоскопическая визуализация кальция в режиме реального времени у свободно движущейся мыши

Аннотация

Источник: Lee, H. et. al., Успешная визуализация кальция in vivo с помощью миниатюрного микроскопа, устанавливаемого на голове, в миндалевидном теле свободно ведущей себя мыши. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует визуализацию кальция in vivo у мыши с использованием градиентного показателя преломления или линзы GRIN и миниатюрного микроскопа. Установка сочетает в себе фиксацию головы в системе подвижных клеток без трения, стимулируя нейроны и вызывая приток ионов кальция. Линзы GRIN улавливают передачу сигналов кальция в мозге, что позволяет визуализировать активность нейронов в режиме реального времени.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол состоит из шести основных этапов: операция по инъекции вируса, операция по имплантации линз с градиентным показателем преломления (GRIN), валидация имплантации линзы GRIN, установка опорной пластины, оптическая регистрация сигнала GCaMP (слияние зеленого флуоресцентного белка (GFP), кальмодулина (CaM) и M13, пептидной последовательности из киназы легкой цепи миозина) во время поведенческого теста и обработка данных (Рисунок 1A). За исключением хирургии, используется коммерческий программный комплекс (Inscopix).

1. Стереотаксическая хирургия – инъекция аденоассоциированного вируса (AAV)
ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм мыши, используемый в этой хирургической процедуре, – C57BL6/J. Во время операции тело животного накрывается стерильной простыней, а все этапы протокола выполняются в стерильных перчатках. Несколько операций обычно не проводятся в один и тот же день. Однако, если нескольким мышам необходимо провести одну и ту же операцию в один и тот же день, используйте отдельный набор автоклавных хирургических инструментов для каждой мыши и 70% этанол для дезинфекции хирургических инструментов между мышами. Чтобы сохранить тепло мыши во время хирургической процедуры, мышь накрывается специально изготовленным хирургическим одеялом после фиксации на стереотаксической раме.

1. Продезинфицируйте все необходимые хирургические инструменты 70% этанолом и подготовьте шприц Hamilton и стеклянную пипетку. Наполните стеклянную пипетку дистиллированной водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты, используемые в протоколе, являются автоклавными. Поскольку линзы GRIN и винты черепа не могут быть автоклавированы для стерилизации, 70% этанол используется в качестве дезинфицирующего средства для предотвращения воспаления. Хотя это не было опробовано, могут быть использованы другие формы стерилизации, например, газовая или химическая стерилизация.
2. Обезболивайте мышей пентобарбиталом (83 мг∙кг-1 массы тела) путем внутрибрюшинного введения. После того, как мышь потеряет сознание, сбрейте шерсть на черепе.
3. Очистите кожу над черепом с помощью 70% этанола и закрепите мышь на стереотаксической раме. Аккуратно снимите кожу и протрите поверхность черепа 35% раствором перекиси водорода с помощью аппликатора с ватным наконечником. Нанесите мазь-смазку для глаз, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя обычно нет проблем с использованием 70% этанола только для асептической подготовки кожи, рекомендуется использовать 3 чередующихся раунда дезинфицирующего средства, например, йодофоров или раствора хлоргексидина, и 70% этанола. В этом протоколе используется более высокая концентрация перекиси водорода, чтобы убедиться, что соединительная ткань на черепе мыши удалена как можно полнее, что имеет решающее значение для уменьшения артефактов движения во время последующей визуализации, поскольку соединительная ткань на черепе препятствует прочному прикреплению опорной пластины к черепу. Следует отметить, что 35% перекиси водорода намного выше, чем обычно используется (3%).
4. Закрепите штифт с помощью держателя стереотаксического щупа. Совместите высоту брегмы и лямбды со штифтом.
5. Найдите конкретное место на черепе мыши для трепанации черепа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты латеральной миндалины (LA) для инъекции вируса равны (AP, ML, DV) = (-1,6 мм, -3,5 мм, -4,3 мм) от брегмы в этом протоколе (AP; передне-задний, ML; медиально-латеральный, DV; Дорсально-вентральный, каждая аббревиатура обозначает относительное осевое расстояние от брегмы). Координаты должны быть оптимизированы для каждого условия эксперимента.
6. Просверлите поверхность черепа (Рисунок 1B). Промойте фракции черепа фосфатно-солевым буфером (PBS). Удалите оставшийся слой с помощью щипцов или иглы 27 G.
   1. При сверлении черепа старайтесь не касаться последнего слоя твердой мозговой оболочки, чтобы не повредить поверхность мозговой ткани. Поврежденная поверхность мозга вызывает воспаление вокруг хрусталика, что приводит к серьезным артефактам движения и высокой автофлуоресценции во время записи. Размер трепанации черепа составляет 1,6 мм. Скорость сверла составляет 18 000 об/мин, а размер сверла — 0,6 мм.
7. Для опускания линзы GRIN от поверхности мозговой ткани просверленного участка к целевому участку миндалевидного тела рассчитайте расстояние, обозначенное как «Значение А», путем вычитания разницы DV между брегмой и открытой поверхностью мозга из DV-координаты имплантации хрусталика, которая устанавливается на основе брегмы (в данном случае 4,2 мм, Рисунок 1С).
8. Загрузите 3 мкл минерального масла и 0,7 мкл раствора вируса AAV в стеклянную пипетку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Минеральное масло помогает отделить раствор вируса от воды. 0,7 мкл - это оптимальный объем для инъекции вируса ЛК, который может полностью покрыть ЛК.
9. Снимите контакт с держателя стереотаксического зонда и закрепите к нему стеклянную пипетку.
10. Расположите стеклянную пипетку в месте инъекции, указанном в шаге 1.5. Вводите стеклянную пипетку в ткани мозга после того, как кровотечение полностью остановится.
11. Подайте вирус через стеклянную пипетку с помощью инъекционного насоса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Титр вируса должен быть выше 1 x 1013 vg/мл для получения достаточного количества GCaMP экспрессирующих клеток. Скорость впрыска составляет 0,1 мкл/мин и диффузия в течение 10 мин. Если есть кровотечение, промойте поверхность мозга PBS. На этом этапе держите поверхность мозга влажной.
12. Закончив инъекцию, медленно извлеките стеклянную пипетку.

2. Стереотаксическая хирургия – имплантация линз GRIN
ПРИМЕЧАНИЕ: Операция по имплантации линз GRIN является наиболее важным этапом в этом протоколе. Поскольку постоянная медленная скорость движения линзы GRIN имеет решающее значение для успешной имплантации линзы GRIN, может быть полезна моторизованная хирургическая рука. Моторизованная хирургическая рука представляет собой стереотаксический манипулятор, который управляется компьютерным программным обеспечением. Хотя в этом протоколе используется моторизованная рука, можно использовать и другие способы, если хрусталик движется последовательно и медленно во время имплантации. Подробная информация об устройстве есть в Таблице материалов.

1. Просверлите череп, чтобы вживить два винта для черепа. Промойте все фракции черепа PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить артефакты движения при последующем оптическом изображении, требуется как минимум два винта. Два винта в виде черепа и положение имплантата линзы GRIN образуют равносторонний треугольник (Рисунок 1B). Размер трепанации черепа должен плотно совпадать с диаметром винта. Если есть кровотечение, промойте кровоточащую поверхность PBS. Скорость сверла составляет 18 000 об/мин, а размер сверла — 0,6 мм.
2. Продезинфицируйте винты 70% этанолом, чтобы предотвратить воспаление. Вживите винты как можно глубже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Винты должны быть плотно закреплены без дополнительной адгезии, например, цемента.
3. Установите моторизованную операционную руку на стереотаксическую раму. Подключите необходимое оборудование к портативному компьютеру, в котором установлено управляющее программное обеспечение (Таблица материалов).
4. Прежде чем опускать линзу GRIN, приготовьтесь к созданию игольчатой дорожки с помощью иглы 26 G.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Игольчатая дорожка — это своего рода направляющая дорожка, которая помогает имплантировать относительно толстую линзу GRIN в глубокие области мозга, такие как миндалевидное тело, не вызывая серьезного искажения структуры мозга вдоль пути инъекции. Эта направляющая дорожка называется игольчатой, потому что она создается путем опускания и подъема относительно тонкой иглы 26 G.
5. Прикрепите держатель канюли, чтобы устойчиво удерживать иглу на стереотаксической раме.
6. Захватите иглу 26 G держателем канюли и рассчитайте координаты места введения иглы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе координаты места введения иглы находятся на расстоянии 50 мкм латерально от места введения вируса (AP, ML, DV) = (-1,6 мм, -3,55 мм, -3,7 мм).
7. Получите доступ к управляющему программному обеспечению и полностью подготовьтесь к изменению положения иглы.
   1. Запустите управляющее программное обеспечение и нажмите кнопку Начать новый проект, чтобы начать сеанс управления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В управляющем сеансе есть несколько пустых полей и кнопок меню. Пустые поля — это поля ввода координат. После ввода координат в пустые поля моторизованная стереотаксическая рука перемещается по нажатию кнопки «Перейти к». Кнопка Go To преобразуется в кнопку СТОП при движении стереотаксического рычага. Из нескольких кнопок меню в этом протоколе требуется только кнопка «Инструмент».
   2. Нажмите кнопку «Инструмент». Откалибруйте управляющее программное обеспечение, нажав кнопку меню Калибровать раму. Калибровка — это процесс, с помощью которого фактическое положение манипулятора устанавливается в виде значений в программном обеспечении Stereodrive.
8. Расположите кончик иглы на открытой поверхности мозга на поверхности черепа с помощью стереотаксического манипулятора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость иглы устанавливается с помощью меню скорости Microdrive в меню Инструменты. Скорость по умолчанию составляет 3,0 мм/с. Однако на этом этапе рекомендуется использовать скорость 0,5 мм/с. Движение иглы контролируется клавишами со стрелками.
9. Добавьте 2-3 капли PBS, чтобы поверхность мозга оставалась влажной. Заполните пустое поле на экране компьютера соответствующими DV координатами LA. Если поверхность мозга сухая, это препятствует проникновению иглы в ткани мозга.
10. Опустите стрелку 26 G, нажав кнопку «Перейти к». Он автоматически останавливается, когда игла достигает целевого места, заданного по координатам DV. Скорость вращения иглы составляет 100 мкм/мин. Если есть кровотечение, остановите иглу, нажав кнопку СТОП, и промойте поверхность мозга PBS. На этом этапе держите поверхность мозга влажной. После того как кровотечение будет остановлено, снова приступайте к опусканию.
11. После того, как игла полностью перестанет двигаться, введите 45.00 мм в пустое поле на экране компьютера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 45.00 мм - это значение координаты DV, которое возвращает иглу в исходное положение.
12. Поднимите иглу, нажав кнопку «Перейти к». Скорость движения иглы составляет 100-200 мкм/мин.
13. После того как игла перестанет двигаться, удалите PBS с поверхности мозга. Снимите держатель иглы и канюли со стереотаксической рамы. Экспериментатор может вручную остановить иглу, нажав кнопку СТОП при необходимости.
14. Оснастите стереотаксический стержень держателем объектива. Установите линзу GRIN на держатель объектива.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется линза GRIN, оптимизированная для наведения на LA (0,6 мм в диаметре, 7,3 мм в длину). Если держатель объектива не подготовлен, альтернативным способом является использование зажима «бульдог» для захвата линзы GRIN.
15. Продезинфицируйте линзу 70% этанолом и прикрепите стереотаксический стержень к стереотаксическим оправам.
16. Расположите кончик линзы GRIN в указанном месте на поверхности черепа (тот же метод, который описан в шаге 2.8).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Координата линзы GRIN равна (AP, ML, DV) = (-1,6 мм, -3,55 мм, -4,2 мм) (Рисунок 1C). Линза не должна касаться черепа, чтобы избежать повреждения его кончика.
17. Рассчитайте координату DV, вычитая абсолютное значение «Значение A» из координаты DV имплантации хрусталика, описанного в шаге 2.16.
18. Капните 2-3 капли PBS на поверхность мозга. Введите 1000 μm для опускания и 300 μm для подъема объектива в пустом поле на экране компьютера.
19. Повторите опускание (на 1000 мкм вниз) и подъем (на 300 мкм вверх) линзы GRIN до тех пор, пока она не достигнет целевого места. Эта процедура вверх и вниз используется для снятия давления, возникающего внутри мозговой ткани из-за процедуры опускания хрусталика, которое в противном случае может вызвать деформацию структур мозга вдоль пути имплантации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость движения линзы GRIN составляет 100 мкм/мин. Даже если есть кровотечение, не прекращайте двигать линзу GRIN и промойте поверхность мозга PBS. На этом этапе держите поверхность мозга влажной. Если поверхность мозга сухая, мозговая ткань прилипает к поверхности линзы GRIN, что приводит к искажению структуры мозга.
20. Если линза GRIN достигает целевого места, удалите PBS и осторожно нанесите стоматологический цемент из смолы вокруг линзы GRIN, винтов и их боковой стенки (Рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение смоляного цемента по всему черепу может уменьшить артефакты движения. И наоборот, если смоляной цемент случайно покроет мышцы, прикрепленные к черепу, он увеличивает артефакты движения.
21. После того как смоляной стоматологический цемент застынет, разберите линзу GRIN с держателя линзы и нанесите акриловый цемент на весь череп (Рисунок 1D).
22. Чтобы прикрепить пластину для головки, разберите держатель объектива из стереотаксического стержня и прикрепите пластину для головки на кончике стержня с помощью лент. Убедитесь, что накладка находится в горизонтальном положении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наклон налобника приводит к наклону обзора. Пластина для головки требуется для фиксации головки мыши в системе клетки мобильного дома (в разделе крепления опорной пластины). Если экспериментатор не использует систему, пропустите этот шаг (шаг 2.22) и следующий шаг 2.23.
23. Медленно опускайте стержень до тех пор, пока пластина головки не окажется в верхней части манжеты объектива. Опустите накладку еще на 1000 мкм. Переместите пластину для имплантированной линзы GRIN так, чтобы она находилась у правого края внутреннего кольца линзы для головы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина для головы должна быть расположена ниже поверхности имплантированной линзы ГРИН; в противном случае микроэндоскоп не сможет приблизиться достаточно близко к имплантированной линзе GRIN для регулировки фокальной плоскости из-за акрилового цемента.
24. Нанесите акриловый цемент для крепления опорной пластины к слоям цемента (Рисунок 1D).
25. Прикрепите парафиновую пленку к имплантированной поверхности линзы GRIN, чтобы защитить поверхность линзы от пыли. Затем нанесите на парафиновую пленку съемный эпоксидный связующий, чтобы парафиновая пленка оставалась на поверхности линзы.
26. Введите в брюшную полость мыши Карпрофен, анальгетик (0,5 мг/мл в PBS), и Дексаметазон, раствор противовоспалительного препарата (0,02 мг/мл в PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доза препарата зависит от массы тела: Карпрофен (5 мг-кг-1 массы тела) и Дексаметазон (0,2 мг-кг-1 массы тела). Карпрофен и дексаметазон назначают после операции и один раз в день в течение 7 дней после операции.
27. Смешайте 0,3 мг/мл амоксициллина, антибиотика, с водой в домашней клетке для введения препарата в течение 1 недели.
28. Верните мышь в домашнюю клетку и дайте 5-8 недель на восстановление и передачу вируса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь восстанавливается в предварительно нагретой клетке на электрическом одеяле до тех пор, пока мышь не придет в себя от анестетика.

3. Валидация имплант<ации линзы GRIN />ПРИМЕЧАНИЕ: Валидация имплантации линзы GRIN дает информацию о том, является ли имплантированная линза GRIN мишенью для клеток, экспрессирующих GCaMP. Основываясь на этой информации, экспериментатор экономит свое время от трудоемких процессов, таких как поведенческий тест и обработка данных, исключая животных с имплантацией линз GRIN не по таргетированию. Во время процедуры валидации клетки с экспрессией GCaMP должны быть сфокусированы в поле зрения записи. На этом этапе используется клетка для мобильного дома. Клетка для мобильного дома представляет собой специализированное устройство круглой формы, которое позволяет мышам с фиксированной головой свободно двигать ногами во время валидации имплантации линзы GRIN и крепления опорной пластины. Подъемный стол в этом аппарате, на котором размещены ноги мышей, закрепленных за головой, обеспечивает такое свободное движение ног, хотя голова неподвижна. Клетки латерального ядра миндалевидного тела обычно спокойны в состоянии покоя или под наркозом, поэтому сигналы флуоресценции GCaMP редко обнаруживаются в этих условиях, что делает очень трудным, а иногда и невозможным обнаружение клеток, экспрессирующих GCaMP, во время валидации имплантации линзы GRIN и прикрепления опорной пластины. Тем не менее, движение ног часто производит флуоресцентные сигналы GCaMP в клетках латерального ядра миндалевидного тела и, таким образом, может помочь найти микроскоп. Таким образом, в этом протоколе используется клетка для мобильного дома.

1. Соберите стереотаксический манипулятор в систему клеток мобильного дома.
2. Обезболите мышь 1,5% газом изофлураном. После того, как мышь полностью потеряет сознание, поместите ее на перекладину для головы системы клеток мобильного дома.
3. Найдите карбоновую клетку под мышью. Закройте карбоновую клетку и включите поток воздуха, чтобы клетка свободно двигалась без трения. Подождите несколько минут, пока мышь станет активной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость воздушного потока должна быть оптимизирована для каждого экспериментального условия (в данном случае 100 л/мин).
4. Удалите парафиновую пленку и эпоксидную смолу с поверхности имплантированной линзы GRIN и протрите поверхность линзы 70% этанолом с помощью бумаги для линз.
5. Подготовьте программное обеспечение для сбора данных (DAQ) (например, Inscopix). Установите условия визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение сбора данных используется для управления микроскопом (мощность светодиодов, фокусировка объектива и т. д.) и хранения данных.
   1. Включите блок сбора данных и подключите к нему микроскоп. Затем подключите его к ноутбуку напрямую с помощью кабеля или через беспроводной интернет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение сбора данных устанавливается в дополнительное оборудование, называемое блоком сбора данных (например, Inscopix). При подключении приставки сбора данных к портативному компьютеру программное обеспечение системы сбора данных становится доступным на портативном компьютере.
   2. Доступ к программному обеспечению сбора данных через интернет-браузер (рекомендуется Firefox).
   3. Установите все необходимые данные (дату, идентификатор мыши и т.д.) в определенном сеансе. Затем нажмите «Сохранить и продолжить». После сохранения откройте сеанс «Выполнить».
   4. Во время сеанса выполнения установите условия изображения, такие как время экспозиции, усиление, электронная фокусировка и мощность светодиода экспозиции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Усиление и мощность светодиода экспозиции можно изменять в зависимости от лабораторных условий. Рекомендуемое значение для электрической фокусировки составляет 500, а время экспозиции — 50 мс. Нет ограничений на изменение мощности светодиода и усиления. Однако более высокая интенсивность света может привести к большему обесцвечиванию. Время экспозиции записи определяет частоту кадров видеозаписи. Более высокая частота кадров снижает интенсивность сигнала. Частота кадров должна быть оптимизирована для GECI, используемых для создания изображений.
6. Чтобы удержать микроскоп на стереотаксическом манипуляторе, прикрепите стереотаксический стержень с захватом для микроскопа к стереотаксическому манипулятору.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Захват представляет собой небольшой аксессуар, который можно прикрепить к стереотаксическому аппарату для удержания корпуса микроскопа для размещения его в целевом месте мозга.
7. Захватите микроскоп с помощью захвата для микроскопа. Включите светодиодный индикатор, подключенный к микроскопу, и выровняйте микроскоп по вертикали. Опускайте микроскоп во время просмотра изображения до тех пор, пока поверхность имплантированной линзы GRIN не покажет себя.
8. Совместите центр имплантированной линзы GRIN с центром изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно провести валидацию имплантации линзы GRIN (указано в разделе результатов, Рисунок 2B, Рисунок 2D, Рисунок 2F).
9. Сделайте снимок поверхности имплантированной линзы GRIN (нажмите кнопку Prt Sc на клавиатуре). Изображение поверхности имплантированной линзы GRIN необходимо для снятия выделения ненейрональных компонентов при последующей обработке данных (шаг 6.8).
10. Найдите подходящее положение микроскопа. Медленно поднимайте линзу объектива микроскопа во время наблюдения за изображением для поиска клеток с экспрессией GCaMP7b.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться регулировка усиления при получении изображения или мощности светодиода экспозиции. На этом этапе может быть проведена валидация имплантации линзы GRIN (упомянута в разделе результатов, Рисунок 2A, Рисунок 2C, Рисунок 2E).

Результаты

Рисунок 1: Схематический рабочий процесс и диаграммы для стереотаксической хирургии для микроэндоскопической визуализации кальция in vivo в ЛА. (A) Схематический рабочий процесс микроэндоскопической визуализации кальция in vivo в ЛК. (B) Микроскопическое...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
26G игла	BD	302002	Хирургия
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE	Addgene	104493-AAV1	Хирургия
AAV2/1-CaMKiiα-GFP	на заказ Хирургия
Акрилово-стоматологический цемент (Ortho-jet Acrylic Pink)	Lang	1334-розовый	Хирургия и крепление опорной пластины
Манипулятор воздушного потока	Neurotar	NTR000253-04	Крепление опорной пластины
Амоксициллин	SIGMA	A8523-5G
Хирургия Углеродная клетка	Neurotar	180 мм x 70 мм	Крепление опорной пластины
Карпрофен	SIGMA	PHR1452-1G	хирургия
Программное обеспечение для обработки данных	INSCOPIX	INSCOPIX Программное обеспечение для обработки данных	Крепление опорной пластины и тест поведения
Дексаметазон	SIGMA	D1756-500MG	Хирургическая
дрель	Seyang	marathon-4	Хирургическая
дрель	ELA	US1/2, Shank104
Хирургическая стеклянная игла	WPI	PG10165-4	Хирургия
Линзы GRIN (INSCOPIX Proview Lens Probe)	INSCOPIX	1050-002208	Хирургия
Шприц Hamilton		84875	Хирургическая
головная пластина	Neurotar	Model 5	Хирургический
ноутбук	Samsung	NT950XBV	Держатель хирургических
линз, Стереотаксический стержень (INSCOPIX proview implant kit)	INSCOPIX	1050-004223	Хирургический
захват для микроскопа	INSCOPIX	1050-002199	Крепление опорной пластины
Микроскоп, программное обеспечение для сбора данных, аппаратное обеспечение	INSCOPIX	nVista 3.0	Крепление опорной пластины и тест поведения
Мобильная домашняя клетка	Neurotar	MHC V5	Крепление опорной
пластины Подвижная рука	Нейростар	Индивидуальная	хирургия
Программное обеспечение для подвижной руки	Neurostar	Custom	Surgery
Съемная эпоксидная связка	WPI	Kwik-Cast	Surgery
Смоляной цемент (Super-bond)	Sun medical	Super bond C&B	Surgery
Skull screw	Stoelting	51457	Хирургия
Стереотаксическая рама	Stoelting	51600	Хирургия
Стереотаксический манипулятор	Stoelting	51600	Крепление опорной плиты