Изоляция и характеристика Hoechst Низкий CD45 Отрицательный Мышь легких мезенхимальных стволовых клеток

Summary

В этой статье мы покажем изоляции мышиного резидент легких мезенхимальные стволовые клетки (легких MSC), их расширение, характеристика и анализ иммуномодулирующими свойствами.

Abstract

Ткань резидент мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются важными регуляторами восстановления тканей или регенерация, фиброз, воспаление, ангиогенез и образование опухолей. Взятые вместе, эти исследования показывают, что резидент MSC легких играть роль в легочной ткани гомеостаза, травм и ремонта в течение таких заболеваний, как легочный фиброз (ПФ) и артериальная гипертензия (ЛАГ). Здесь мы опишем технологию для определения населения резидентов MSC легких. Определение этой категории населения в естественных условиях легочной ткани с помощью определить набор маркеров облегчает повторное изоляции хорошо известных населению стволовых клеток путем проточной цитометрии и изучение определенного типа клеток и функции.

Protocol

1. Легкого Изоляция

1. Жертвы взрослых мышей (8-10 недель в возрасте, 18-20 г; C57Bl6J) мышей с передозировкой изофлуран следует обескровливание с использованием стерильной техники. Профили будут незначительно отличаться между штаммами.
2. Хирургическим путем удалить диафрагмы, открывают грудную полость, сокращая грудную клетку с боков на каждой стороне мыши. Флеш кровь из легких, перфузии правого желудочка сердца аккуратно с использованием 3-5mls фосфатного буферного раствора (PBS).
3. Рассеките легких долях удаления трахеи и крупных бронхов и поместить в чашку Петри, заполненные Хэнкс буферном растворе (HBSS). После сбора всех долях легких щипцы используются для размещения ткани на крышке блюдо. Ткань затем фарш на мелкие части, используя одноразовые скальпели с достаточно жидким, чтобы держать их влажной, но не так много, что они плавают и двигаться.
4. Рассеките задних конечностей одной из мышей и изолировать костного мозга для использования в качестве окрашивания управления для установки флош цитометрии ворота. Пятно костного мозга (КМ), как описано выше ^1.

2. Подготовка суспензии отдельных клеток, из легких тканей

1. Каждое легкое переваривается с помощью оптимизированной веса ткани к объему в 0,2 г: 5mls предварительно нагревается 0,2% Уортингтон 2 типа коллагеназы (Уортингтон Biochemicals, Лейквуд, штат Нью-Джерси; кошка # LS004202), растворенной в стерильной HBSS. Смесь погружают в 37 ° С на водяной бане 30 мин ^2,3.
2. Измельченного в порошок образца хорошо, пока переварить легочной ткани легко течет через пипетку 10 мл (примерно 10 повторений). Инкубировать еще 15 мин при 37 ° С для завершения ткани дайджесты и обеспечивает более равномерное суспензии отдельных клеток.
3. Развести подвеску легкого с HBSS и растирают с 5 мл пипетки, чтобы рассеять остаточное фрагментов ткани.
4. Фильтры подвески использованием 70μM сито ячейка для удаления непереваренных фрагментов ткани. Пример можно разделить на multiplэлектронной конических труб в этом месте, чтобы предотвратить перегрузку одной ячейки фильтра и уменьшить время.
5. Гранул суспензии клеток в течение 10 мин при 1500 оборотах в минуту и ​​переливать супернатант.
6. Ресуспендируют осадок клеток осторожно использованием комнатной температуре лизиса буфер (eBiosciences, Сан-Диего, Калифорния; кошка # 00-4333-57) и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить равный объем HBSS для инактивации лизис буфером и фильтром клеточной суспензии использованием 40 мкм сито ячейка для удаления мусора и клеточных агрегатов.
7. Внесите 10 мкл каждого образца, чтобы быть окрашены и подсчета количества клеток для обоих легких и BM образцов с использованием гемоцитометра. Примечание: запись общего объема клеток.
8. Гранул суспензии отдельных клеток легких клетки центрифугированием при 1500 оборотов в минуту в течение 10 мин.
9. Ресуспендируют обоих легких и Б. клеток 1х10 ^{6 кл} / мл в предварительно нагретого (37 ° С) DMEM + (среда Дульбекко изменение Орла, высокий уровень глюкозы (Gibco, Карлсбад, Калифорния; кошка # 11965-092), содержащей 2% фетальной Бовипе сыворотки (FBS) и 10 мМ HEPES.
10. Подготовка 1mg/ml решение запас Hoechst 33342 красителя (Sigma Chemical Company, Сент-Луис, штат Миссури; кошка # B2261) в воде и фильтр стерилизовать ^1,4. Красителем Hoechst могут быть сохранены как аликвоты при -80 ° C.
11. Добавить Hoescht 33342 красителя конечной концентрации 5μg/ml (200x разбавления акции 1mg/ml) для суспензии отдельных клеток.
12. Смешайте клетки, аккуратно инверсии и инкубировать в 37 ° С на водяной бане ровно 90 минут.

3. Окрашивание и приготовления суспензии клеток легких для анализа потока цитометрии

1. Через 90 минут все шаги с Hoechst окрашенных клеток легких должны быть выполнены при температуре 4 ° С или на лед, чтобы предотвратить отток красителя. Гранул клетки центрифугированием при 1500 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируйте клеток в ледяного буфера окрашивания (PBS +2% FBS).
2. Ресуспендируют клетки в концентрации не более 1х10 ^{7 клеток}

1. >

&

Discussion

Мы адаптировали метод первоначально использовался для выявления Б. М. гемопоэтических клеток, чтобы изолировать специфической популяции резидентов MSC легких. Из-за воспроизводимость изоляции этих клеток были тогда хорошо охарактеризованы как MSC. Их происхождение было определено в качестве резидента в легких взрослой мыши (в отличие от Б. М. производные) и фенотипические и молекулярного профиля документально ^2. Способность неоднократно изолировать эту характеризуется населения позволяет дальнейшее изучение биологических значение и роль легких MSC в гомеостаз ткани и болезней. Последнее определение этой категории населения в естественных условиях и в мышиной и человеческой легочной ткани способствует развитию терапевтической стратегии, направленной на спасение эндогенные клетки для облегчения легкого ремонта в течение травмы и болезни.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (необязательно)
Фосфатным буферным раствором (PBS)	Сигма	P-5368
Хэнкс буфер солевом растворе (HBSS)	Thermo Scientific	SH30588.01
0,2% Уортингтон 2 типа коллагеназы	Уортингтон Biochemicals	LS004202
Красные клетки крови лизирующего буфера	eBiosciences	00-4333-57
DMEM	Invitrogen Gibco	11965-092
Hoechst 33342 красителя	Сигма	B2261
CD45-APC	BD Pharmingen	559864
Пропидий йодида	Сигма	81845
-MEM	Thermo Scientific	SH30265.01	;
FBS	Invitrogen	16000-069
0,5% трипсина / ЭДТА	Cellgro	25-053-Cl
Полный средний MesenCult	Stem Cell Технологии	05511
0,4% вес / объем Гимза красящим раствором	Сигма	GS1L
4% параформальдегида	Услуги электронной микроскопии	15710	16% paraformeldehyde разбавляют до 4% с помощью PBS
Карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE)	Сигма	21888