Визуализация сосудистого сплетения головного мозга мыши с помощью сканирующей электронной микроскопии

Аннотация

Источник: Van Wonterghem, E., et al. Микродиссекция и сканирующая электронная микроскопия полного монтирования визуализации сосудистого сплетения мыши. J. Vis. Exp. (2022)

Это видео демонстрирует подготовку и визуализацию ткани сосудистого сплетения из мозга мыши с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Процесс включает в себя фиксацию тканей, обезвоживание и покрытие проводящим слоем платины для стабилизации и подготовки образца к визуализации. SEM позволяет получить подробные изображения эпителиальных клеток с микроворсинками, что дает представление о структурных особенностях ткани.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Морфологический анализ ткани сосудистого сплетения (ЦП) с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)

ВНИМАНИЕ: Токсичные растворы используются на следующих этапах обработки. Пробоподготовку рекомендуется проводить в вытяжном шкафу.

1. Выполните подготовку образца для СЭМ, как описано ниже.
   1. Перенесите свежий выделенный ЦП в свежеприготовленный фиксирующий раствор, содержащий 2% параформальдегида и 2,5% глутаральдегида в 0,1 М буфере Na-какодилата (pH 7,4). Инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ткань CP очень хрупкая и тонкая, ткань следует поместить в небольшие корзины для образцов (см. Таблица материалов) для переноса между буферами. Таким образом, структура ткани будет лучше сохраняться. Фиксатор на основе какодилата используется вместо фиксатора на основе фосфатно-солевого буфера (PBS), так как сильный буфер какодилата может противостоять низкому pH глутаральдегида в ЭМ-фиксаторе.
   2. Промойте образец 3 раза в течение 5 минут каждый с 3-5 мл 0,1 М Na-какодилатного буфера (pH 7,4).
   3. Предварительно зафиксировать образцы в 3-5 мл 2% тетраоксида осмия в 0,1 М буфере из Na-какодилата в течение 30 минут. Промойте образцы 3 раза в течение 5 минут каждый 3-5 мл сверхчистой воды.
   4. Обезвоживайте образцы в серии ледяных растворов с возрастающей концентрацией этанола (EtOH) (50%, 70%, 85%, 100%) в течение 15 минут на каждый раствор EtOH. Используйте сушилку для критических точек, чтобы правильно высушить пробу. ПРИМЕЧАНИЕ: Переход из жидкой фазы в газообразную влияет на поверхностное натяжение, вызывая повреждение поверхностной структуры. Этап сушки в критической точке позволяет сохранить структуру поверхности.
   5. Осторожно расположите образец на креплении образца с карбоновой наклейкой (см. Таблица материалов).
   6. Покройте образцы тонким слоем (2-5 нм) платины. Для этого установите платиновый источник в вакуумную систему между двумя сильноточными электрическими клеммами и нагрейте платину до температуры испарения. На пробу наносится мелкая струйка платины. ПРИМЕЧАНИЕ: Помимо платины, также можно использовать золото или золото/палладий.
2. Визуализируйте образцы CP с помощью SEM (см. Таблица материалов). Процедура визуализации ЦП ткани через SEM аналогична процедуре визуализации других типов тканей и зависит от используемого программного обеспечения и инструментов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Алюминиевые крепления для образцов	EM Sciences	75220
Буфер для какодилатов	EM Sciences	11652
Углеродные клеевые вкладки -12 мм	EM Sciences	77825-12
Сушилка для критических точек	Bal-Tec	CPD030
Crossbeam 540	Zeiss		SEM система
Щипцы	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Глутаральдегид	EM Sciences	16220
Тетраоксид осмия	EM Sciences	19170
Параформальдегид	Sigma-Aldrich	P6148
Фосфатный буферный раствор (PBS)	Lonza	BE17-516F
Platinum	Quorum	Q150T ES	PBS без Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ или фенолового красного; стерильная фильтрованная
корзина для образцов из нержавеющей стали	EM Sciences	70190-01