Флуоресцентная визуализация динамики синаптического кальция в модели бокового амиотрофического склероза in vitro

Аннотация

Источник: Krishnamurthy, K. et al. Флуоресцентное измерение синаптических функций в реальном времени на моделях бокового амиотрофического склероза. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует визуализацию кальция в реальном времени для мониторинга синаптической активности в нейронах с мутацией БАС, экспрессирующих генетически кодируемый биосенсор кальция. В нем описываются этапы подготовки нейронов к визуализации, стимуляции динамики кальция и регистрации флуоресценции для измерения изменений внутриклеточных уровней кальция в режиме реального времени, которые отражают синаптическую активность нейронов.

Протокол

1. Флуоресцентная визуализация кальциевых транзиентов Gcamp6m

1. Трансфектируйте первичные корковые нейроны грызунов, культивируемые на чашках со стеклянным дном 35 мм с 500 нг Gcamp6m.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При желании сотрансфектируйте нейроны с интересующей плазмидой, содержащей флуоресцентную метку в красном или дальнем красном диапазоне.
2. Инкубируйте нейроны с искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF) с низким содержанием хлорида калия (KCl) (табл. 1) в течение 15 мин, через 48 ч после трансфекции, а затем установите чашку на платформу визуализации.
3. Визуализируйте флуоресценцию GCaMP6m с помощью фильтра флуоресцеина изотиоцианата (FITC) (488 нм) и объектива с 20-кратным или 40-кратным увеличением.
4. Выберите поле съемки и обеспечьте идеальную фокусировку. Затем возьмите одно неподвижное изображение со светлопольными, FITC и флуоресцентными маркерными каналами для обозначения границ нейронов.
5. Запустите функцию «Запустить сейчас» в программном обеспечении для сбора данных. Проведите базовую регистрацию в течение 5 минут, а затем проведите перфузию с помощью аКСФ, содержащего 50 мМ KCL (Таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этой визуализации является измерение вызванных кальциевых переходных процессов. Если нейрон обладает базальной активностью возбуждения и потоками кальция в период до стимуляции, он не используется в анализе данных. Вместо этого используются только клетки со стабильной фоновой флуоресценцией. Периоды постстимуляции также могут быть продлены до 60 минут для переходных процессов кальция, с дополнительной непрерывной перфузией с высоким содержанием KCl или без нее.
6. Сохраните эксперимент и проанализируйте данные с помощью конфокального программного обеспечения. На этом эксперимент может быть остановлен, а анализ может быть выполнен позже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки не нуждаются в трансфекции для экспрессии белков, представляющих интерес, этот протокол может быть выполнен в любой момент времени in vitro при исследовании кальциевых транзиентов. После тестирования контрольных клеток, чтобы убедиться в измерении переходных процессов кальция, экспериментатор должен быть слеп к генетическим или фармакологическим условиям каждой тестируемой чашки, чтобы свести к минимуму систематическую ошибку.

2. Анализ изображений:

1. Открытая интервальная съемка с помощью конфокального программного обеспечения.
2. Выравнивание изображений в рядах интервальной съемки с помощью серии команд: Image | Переработка | Выровняйте текущий документ. Выберите «Выровнять по первому кадру».
3. Выберите области интереса (ROI) вдоль нейритов с помощью инструмента выбора ROI, значка в форме боба справа от рамки изображения. Кроме того, отметьте ROI, представляющий интенсивность фоновой флуоресценции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ROI выбираются путем выбора областей четко разделенных точек вдоль нейронных дорожек, обозначенных светлым неподвижным изображением. Для анализа выбирается не менее пяти ROI на нейрон. Фоновый ROI выбирается в области поля зрения, которая не содержит нейритов.
4. Измерьте необработанную флуоресценцию с течением времени для выбранных ROI с помощью следующей серии команд: Measure | Измерение времени.
   1. Запустите функцию измерения в верхней части панели измерения времени. Генерируется графическое представление исходной флуоресценции во времени и количественные данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая точка данных представляет собой исходную флуоресценцию для этого ROI для кадра, связанного с этой конкретной измеренной точкой времени.
5. Экспортируйте необработанные интенсивности флуоресценции в программное обеспечение для работы с электронными таблицами.

Таблица 1: Состав буферов искусственной спинномозговой жидкости (аКСФ).

Low KCL aCSF buffer (pH от 7,40 до 7,45)
Концентрация	реагента
HEPES	10 мМ
NaCl	140 мМ
KCl	5 мМ
глюкоза	10 мМ
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1 mM
Буфер aCSF с высоким содержанием KCL (pH от 7,40 до 7,45)
Концентрация	реагента
HEPES	10 мМ
NaCl	95 мМ
KCl	50 мМ
Глюкоза	10 мМ
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1 mM

Материалы