Двухфотонная голографическая микроскопия для изучения нейронной активности и связности в модели мыши

Аннотация

Источник: Kato, D. et. al., Оценка и манипулирование нейронной активностью с помощью двухфотонной голографической микроскопии. J. Vis. Exp. (2022)

Это видео демонстрирует метод двухфотонной визуализации в сочетании с оптогенетикой с использованием голографической микроскопии. Используя пространственный модулятор света, этот метод обеспечивает точную стимуляцию нейронов, экспрессирующую чувствительную к красному свету визуализацию белка и кальция с минимальным фотоповреждением. Этот подход позволяет получить представление о функциональной связности и организации нейронных сетей.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Имплантация головной пластины (Рисунок 1A)

1. Введите анестетик (смесь 74 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина) внутрибрюшинно для обезболивания мыши. Часто проверяйте состояние анестезии мыши, оценивая рефлексы педалей.
2. После анестезии поместите мышь в стереотаксический инструмент. Нанесите глазную мазь (см. Таблица материалов), чтобы предотвратить высыхание роговицы при имплантации головной пластины.
3. Побрейте операционную область и продезинфицируйте кожу тремя чередующимися циклами скрабов с повидон-йодом или хлоргексидином, а затем салфетками с 70% спиртом. Осторожно обнажите череп и очистите его ватными палочками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты должны быть стерилизованы, и все процедуры должны выполняться соответственно. Любой оставшийся мусор (например, волосы или засохшая кровь) вызывает воспалительные реакции. Поэтому любой мусор следует удалять под стереоскопом с помощью ватных тампонов, смоченных в стерильной воде или 70% спирте.
4. Используйте стереотаксические координаты - передняя и задняя = 0,5 мм, медиальная и латеральная = 1,5 мм от брегмы - чтобы найти центр трепанации черепа и обозначить его маркером.
5. Поместите изготовленную на заказ головную пластину в центр черепа. Затем нанесите стоматологический цемент (см. Таблица материалов), чтобы прочно зафиксировать его на черепе. Слегка надавливайте до тех пор, пока головная пластина не станет плотно соприкасаться с передней и задней частями черепа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает примерно 20 минут и имеет решающее значение для уменьшения артефактов движения в мозге во время двухфотонной визуализации. Размеры накладки составляют от 20 мм × 40 мм × 1 мм с отверстием в форме домашней пластины, с одним краем длиной 15 мм, двумя смежными сторонами длиной 3 мм и двумя оставшимися сторонами длиной 10 мм.
6. Смешайте стоматологический адгезивный смоляной цемент на акриловой основе следующим образом: полложки порошка, три капли жидкости и одна капля катализатора (см. Таблица материалов). Чтобы предотвратить высыхание, нанесите этот цемент со смешанной стоматологической адгезивной смолой на неповрежденную поверхность черепа мыши с помощью головной пластины.
7. Поместите мышь в теплую клетку до тех пор, пока она не оправится от наркоза. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.

2. Хирургическое вмешательство и инъекция аденоассоциированного вируса (AAV) (Рисунок 1B)

1. Выполните трепанацию черепа или вирусную инъекцию без удаления стоматологического адгезивного смоляного цемента из черепа через 1 день после имплантации головной пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Введите анестезию (смесь 74 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина) внутрибрюшинно мыши во время этой процедуры.
2. Чтобы избежать отека мозга, введите дексаметазона натрия фосфат (1,32 мг/кг) внутрибрюшинно за 1 ч до операции.
3. Обезболивайте мышь головной пластиной с 1% изофлурановой анестезией с помощью вапорайзера (системы доставки анестезии) с поддержанием температуры тела с помощью грелки. Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
4. Под стереоскопом проведите круговую трепанацию черепа диаметром примерно 2 мм с помощью бормашины. Чтобы уменьшить повреждение головного мозга, работайте с бормашиной осторожно, с постоянным легким движением и легким давлением вниз.
5. Удалите костные отломки несколько раз с помощью отсасывающей системы. После удаления костных фрагментов используйте раствор искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) для удаления и промывания любого мусора, оставшегося на поверхности мозга. Повторите эту чистящую процедуру несколько раз, чтобы подавить воспалительные реакции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор ACSF (140 мМ хлорида натрия, NaCl, 2,5 мМ хлорида калия, KCl, 5 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновая кислота, HEPES, 2,0 мМ хлорида кальция, CaCl₂ и 1,0 мМ хлорида магния, MgCl₂) хранили при 4 °C в течение 1 месяца после растворения и фильтрации реагента (размер пор = 0,22 мкм).
6. Используя систему впрыска под давлением (см. Таблица материалов), установите соответствующее давление (около 10 фунтов на квадратный дюйм (PSI) в импульсах длительностью 4 мс) для введения 500 нл раствора AAV через стеклянный капилляр с диаметром наконечника 10-20 мкм (приготовленный с помощью пуллера микропипетки) в течение 10 мин.
7. Определите, вводится ли раствор AAV в мозг путем проверка, постепенно ли снижается уровень раствора AAV в стеклянном капилляре.
8. Оставьте стеклянный капилляр на месте еще на 10 минут, чтобы предотвратить обратный поток. Повторите три раза, чтобы ввести в мозг в общей сложности 1,5 мкл раствора AAV.
9. Для оценки и манипулирования нейронной активностью в пирамидальных клетках слоя 2/3 (L2/3) введите раствор AAV (для визуализации Ca²⁺: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE при 1,28 × 10¹⁴ векторных геномов/мл, разведенных 1:1 в физиологическом растворе; для визуализации Ca²⁺ с оптогенетикой: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE при 1,73 × 10¹⁴ векторных геномов/мл, разведенный в солевом растворе 1:1) в область задней лапы первичной соматосенсорной коры мышей дикого типа (S1, центрированный на 0,5 мм сзади и 1,5 мм латерально от брегмы, на глубине 150 мкм от поверхности).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор AAV следует вводить за 2-3 недели и 1-2 недели до визуализации для экспрессии jGCaMP8f и GCaMP6m-P2A-ChRmine соответственно.
10. После нанесения 2% (w/v) легкоплавкой агарозы на поверхность мозга S1 с помощью микропипетки поместите стеклянное окно над краниотомией с двумя покровными стеклами. Прикрепите два защитных стекла (маленький диаметр 2,0 мм и большой диаметр 4,5 мм; см. Таблица материалов) с помощью ультрафиолетового (УФ) отверждаемого клея.
11. Прижмите защитное стекло к агарозе, пока она еще жидкая; Это препятствует образованию пузырьков воздуха в агарозе. Заклейте края черепного окна стоматологическим и адгезивным смоляным цементом (Рисунок 1C).
12. Извлеките мышь из стереотаксического инструмента и верните ее в корзину. Поместите мышь в теплую клетку и не возвращайтесь в клетку с другими животными до тех пор, пока она полностью не оправится от наркоза. Тщательно поддерживайте стерильные условия во время операции по выживанию.
13. В течение первых 72 часов после операции проверяйте состояние здоровья мыши, наблюдая за общим поведением. Если есть какие-либо отклонения в общем поведении, подкожно вводят противовоспалительные и обезболивающие средства.

3. Подготовка к голографической стимуляции или системе освещения (Рисунок 2)

1. Откалибруйте систему голографической стимуляции, поместив поверхность красного флуоресцентного предметного стекла (литой акриловой подложки) в плоскость образца. Переведите микроскоп в режим съемки в реальном времени со слабым возбуждающим светом и запустите файл calibration_GUI.m. Проверьте панель параметров и нажмите кнопку Сохранить .
2. Нажмите кнопку Z Scan на панели шага 1. Он автоматически сгенерирует три случайных пятна во всех 21 осевых плоскостях, удаленных друг от друга на 2 мкм от каждой плоскости.
3. Переместите ползунок и проверьте живое изображение. Найдите идеальную плоскость, на которой пятна кажутся самыми маленькими и яркими, а затем нажмите кнопку Сохранить . Это автоматически сгенерирует смещенный сферический волновой фронт для цифровой голограммы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если вам не удается найти самые яркие флуоресцентные пятна, измените минимальное и максимальное значения диапазона сканирования и повторите попытку.
4. Нажмите кнопку Go на панели шага 2, а затем щелкните шесть точек в левом квадрате. Проверьте изображение в реальном времени. Если есть шесть различимых флуоресцентных пятен, введите их оси x и y в поля редактирования и нажмите кнопку Сохранить . Это автоматически сгенерирует коэффициенты аффинного преобразования для координации калибровки между голографической стимуляцией и системой визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Номер пары осей и номер спота, по которому был сделан щелчок, должны совпадать по порядку. Если вы не уверены или на вашем изображении нет пятен, попробуйте еще раз и создайте уникальный узор пятен или выберите меньший диапазон вокруг центра поля зрения (FOV).
5. Нажмите кнопку Сканировать на панели шага 3. Он будет генерировать 441 цифровую голограмму для выполнения сканирования одной точки по полю зрения за 21 × 21 шаг.
   1. Во-первых, проверьте изображения, меняя шаблоны в списке. Затем отрегулируйте мощность лазера для получения точечных изображений в динамическом диапазоне устройства визуализации (например, чтобы избежать чрезмерно насыщенных изображений).
   2. Затем отрегулируйте время интервала в поле ввода; Время интервала должно быть более чем в два раза больше времени интервала записи. Наконец, переведите устройство обработки изображений в режим записи и нажмите кнопку Play . Если воспроизведение завершится, в командном окне появятся строки "display OK". Остановите запись и сложите записанные последовательные изображения с помощью метода максимальной интенсивности.
6. Нажмите Сгенерировать WM на панели шага 4 и выберите сложенное изображение сверху. Затем закройте окно calibration_GUI. Он автоматически сгенерирует карту веса, чтобы компенсировать несбалансированную интенсивность в каждой точке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для более подробного описания код MATLAB можно скачать отсюда (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. Ca²⁺ визуализация с помощью датчика изображения с голографической подсветкой (Рисунок 3)

}
1. Поместите мышь, введенную AAV, с пластиной для головы под микроскоп (Рисунок 1D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой процедуры мышь удерживается в бодрствующем состоянии, но способна избежать неприятных раздражителей.
2. Выполните двухфотонную визуализацию (режим точечного сканирования) с помощью голографического микроскопа и сапфирового лазера Ti: с синхронизацией мод, настроенного на 920 нм, с 25-кратным объективом (см. Таблица материалов).
3. Включите коммерческое программное обеспечение для обработки изображений (см. Таблица материалов). В режиме визуализации в реальном времени отрегулируйте напряжение детектора изображения (см. Таблица материалов) и мощность лазера для визуализации, чтобы оптимизировать яркость нейронов, экспрессирующих jGCaMP8f. Сделайте снимки нейронов, экспрессирующих этот белок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность лазера для визуализации (920 нм) составляет 20-30 мВт. Поле зрения составляло 512 мкм × 512 мкм на глубине 100-150 мкм от поверхности коры головного мозга.
4. Чтобы осветить определенные нейроны, экспрессирующие jGCaMP8f, голографической подсветкой, запустите файл скрипта SLMcontrol.m. Нажмите на Reference Image и выберите изображение, полученное выше. Затем нажмите кнопку Spot , чтобы выбрать определенные пиксели на нейронах на изображении непрерывным щелчком мыши (Figure 3A). Если выбор завершен, нажмите кнопку Enter на клавиатуре, чтобы завершить его.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цифровая голограмма автоматически рассчитывается и отображается на пространственном модуляторе света (SLM). Этот шаблон также можно пересмотреть, щелкнув по списку. Пространственное разрешение одного пятна, генерируемого SLM, составляло примерно 1,2 мкм в поперечном направлении и ~8,3 мкм по оптической оси. Мы использовали объектив с высокой числовой апертурой (1,1) для достижения более локализованной голографической стимуляции.
5. Чтобы обнаружить нейронную активность с высоким временным разрешением с помощью датчика изображения (см. Таблица материалов), установите время экспозиции, область изображения и биннинг (Рисунок 3B) перед получением изображения (Рисунок 3C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность голографического лазера (920 нм), который непрерывно стимулирует один нейрон, составляет 2 мВт, что достаточно для обнаружения нейронной активности. Например, для достижения частоты кадров 100 Гц для изображения время экспозиции составляет 9 мс, область изображения — 400 мкм × 400 мкм, а биннинг — 4.
6. После эксперимента верните мышь в домашнюю клетку.

5. Двухфотонная визуализация (режим точечного сканирования) с помощью оптогенетики с использованием голографического микроскопа (рис. 4)

1. Повторите шаги 4.1 и 4.2.
2. Включите коммерческое программное обеспечение для обработки изображений (см. Таблица материалов). В режиме визуализации в реальном времени отрегулируйте напряжение детектора изображения (см. Таблица материалов) и мощность лазера для визуализации, чтобы оптимизировать яркость нейронов, экспрессирующих GCaMP6m-P2A-ChRmine. Сделайте снимки нейронов, экспрессирующих эти белки (Рисунок 1E).
3. Повторите шаг 4.4.
4. Чтобы исследовать функциональную связь в нейронах L2/3, используйте SLM для генерации голографических паттернов оптогенетической стимуляции (ChRmine; 1,040 нм) и объедините его с двухфотонной визуализацией Ca²⁺ (GCaMP6m; 920 нм, 512 × 512 пикселей, 2 Гц или 30 Гц, 2-кратный цифровой зум, режим точечного сканирования; Рисунок 3D-H).
   1. Для этого протокола установите интенсивность лазера визуализации на 920 нм на 10-20 мВт, а поле зрения на 256 мкм × 256 мкм, измеренное на глубине 100-150 мкм от поверхности коры головного мозга. Установите время задержки пикселя на 1,5 мкс для 2 Гц или 100 нс для 30 Гц.
   2. Чтобы увидеть, вызвал ли один голографический стимул реакцию кальция в нейронах, используйте 2 Гц и 30 Гц в качестве частоты кадров изображения. Установите интенсивность лазера голографической стимуляции (1040 нм), который стимулирует один нейрон, на уровне 10 мВт, что достаточно для индуцирования нейронной активности (Рисунок 3D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пространственное разрешение одного пятна, генерируемого SLM, составляет примерно 1,2 мкм в поперечном направлении и ~8,3 мкм в оптическом направлении. Диапазон доступного объема в боковом направлении составляет около 500 мкм × 500 мкм и 100 мкм в осевом направлении. Мы также подтвердили с помощью визуализации Ca²⁺ с частотой кадров 2 Гц или 30 Гц, что не только один нейрон, но и несколько нейронов могут быть голографически стимулированы одновременно (Рисунок 3E).
5. Получение изображения выполняется по следующему протоколу: одновременное изображение ответа Ca²⁺ на длине волны 920 нм с 10 голографическими стимулами на длине волны 1 040 нм с с интервалом 8 с (0,125 Гц) в течение 50 мс после исходного периода 10 с.

Результаты

Рисунок 1: Схематический контур экспериментальной процедуры. (A) Фиксация головной пластины к черепу. (B) Стереотаксическая инъекция AAV в область задней лапы первичной соматосенсорной коры (S1HL). (В) И...

Материалы