Визуализация кальция медиальной префронтальной коры мыши в режиме реального времени с помощью минископа

Аннотация

Источник: Thapa, R., et. al., Стереотаксическая инъекция вируса и имплантация линз с градиентным индексом для глубокого мозга In Vivo Визуализация кальция. J. Vis. Exp. (2021)

Видео демонстрирует визуализацию кальция в реальном времени с помощью минископа в трансдуцированной мыши, коррелируя активность нейронов с поведением.

Протокол

Установка минископа и in vivo Ca²⁺ imaging (Рисунок 1)

1. Установите минископ на его основание
   1. Кратковременно обезболите мышь в индукционной камере (5% изофлурана и 1 л/мин потока кислорода). Поместите мышь на чистую поверхность скамейки.
   2. Ослабьте стопорный винт с помощью небольшой отвертки, снимите защитный колпачок и очистите поверхность линзы GRIN (Gradient-index lens) ватной палочкой, смоченной в ацетоне.
   3. Плотно оберните ленту из ПТФЭ (политетрафторэтиленовая лента) вокруг резьбы минископа и закрепите минископ на ее основании на головке мыши.
   4. Подключите минископ к кабелю (Рисунок 2K) и включите программное обеспечение NeuView.
   5. В NeuView нажмите Hardware, проверьте LED1 и нажмите кнопку Stream , чтобы просмотреть живые изображения (Figure 3A).
   6. Определите наилучшую фокальную плоскость, отрегулировав положение минископа относительно основания, слегка подтянув или ослабив с помощью тупых щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучшая фокальная плоскость определяется путем сравнения нескольких возможных мест и выбора того, которое имеет четкую визуализацию большинства клеточных тел.
   7. Затяните стопорный винт и поместите мышь обратно в домашнюю клетку.
   8. В NeuView отрегулируйте мощность светодиодной подсветки до оптимального уровня. Нажмите на Захватите , а затем Нажмите кнопки , чтобы начать запись, и нажмите Стоп после 150 кадров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимально возможная мощность определяет оптимальный уровень мощности светодиода для достижения достаточно яркого изображения. Цель записи короткого видео — облегчить идентификацию той же фокальной плоскости в будущем для повторяющихся изображений.
   9. Отсоедините кабель от минископа. Дайте мыши восстановиться не менее 30 минут, прежде чем начинать эксперимент.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для защиты минископа, как правило, бутылка с водой и проволочный механизм подачи пищи снимаются в течение этого короткого периода времени. Если мышь нуждается в более длительном пребывании в домашней клетке, рекомендуется поставлять в домашнюю клетку имеющийся в продаже пищевой гель (см. Таблица материалов).
2. Сбор данных для in vivo} кальциевая визуализация
   ПРИМЕЧАНИЕ: in vivo, визуализация кальция может проводиться одновременно с любыми поведенческими тестами, которые пожелает. В демонстрационных целях здесь приведен пример визуализации in vivo Ca²⁺ во время испытания в открытом поле. Для достижения этой цели требуется два компьютера. Один компьютер оснащен коммерческим программным обеспечением (см. Таблица материалов) для управления камерой и автоматической записью поведения мыши. Другой компьютер оснащен системой NeuView для управления минископом и записи изображений Ca²⁺.
   1. Включите программное обеспечение поведенческой камеры (см. Table of Materials), чтобы просмотреть поведенческую арену мыши с помощью функции Livestream. Вручную отрегулируйте фокусировку верхней камеры (Рисунок 2L).
   2. Выберите Триггер/Стробоскоп и отметьте "Включить/выключить триггер" (Рисунок 3B). Нажмите кнопку Record , используйте Browse , чтобы выбрать место, где будут сохранены записи поведения, и выберите нужный формат изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Функция "Управление триггером" включена, чтобы позволить программе NeuView запускать запись поведения так, чтобы кадры поведения и соответствующие кадры изображения кальция были временно связаны друг с другом. Запись поведения может быть сохранена в любом желаемом формате. Запись поведения обычно сохраняется в формате JPEG в указанной папке.
   3. Поднесите мышь ближе к арене и подключите минископ к кабелю, подключенному к системе сбора данных (Рисунок 2L) (см. Таблица материалов). Затем мышь помещается в центр арены.
   4. С помощью функции Livestream программного обеспечения NeuView можно регулировать мощность светодиода для оптимизации яркости изображения кальция.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для кальциевой визуализации частота кадров записи по умолчанию составляет 10 кадров в секунду.
   5. В NeuView снимите галочку с LED1, нажмите на Захват, , а затем Активируйте кнопки , чтобы начать запись, и нажмите Стоп после 100 кадров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это для записи фоновых изображений в течение примерно 100 кадров с выключенным светодиодным светом.
   6. В программном обеспечении поведенческой камеры нажмите Начать запись (Рисунок 3C). В NeuView проверьте LED1, нажмите на Capture, а затем кнопки Trigger , чтобы начать запись. Нажмите Стоп после 3000 кадров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это для одновременной записи изображения кальция и его поведения. Тест в открытом поле длится 15 минут, обычно разбивается на три сессии записи по 5 минут каждая. Это необходимо для предотвращения перегрева минископа из-за продолжительного использования.
   7. Сохраните изображения кальция и записи поведения в соответствующих папках. Повторяйте запись еще два сеанса, записывая фон перед каждым сеансом, и сохраняйте все записи в указанной папке.

Результаты

Рисунок 1: Схематический обзор экспериментальной процедуры. (A) Стереотаксическая инъекция вируса в mPFC (медиальную префронтальную кору). (B) Имплантация линзы GRIN (Gradient-index lens) в mPFC. (C

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ацетон	Sigma-Aldrich	179124-1L	GRIN очиститель объектива
Программное обеспечение для перекодирования поведения (Point Grey FlyCap2)	Point Grey	Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C	Для записи поведения
Сбор данных контроллер	NIDA/IRP	Специально разработанный	Компонент системы сбора изображений
Кабель передачи данных	NIDA/IRP	Специально разработанный	Компонент системы сбора изображений
GRIN объектив	GRINTECH	NEM-100-25-10-860-S	Для имплантации линз GRIN
База минископа	Protolabs	Специально разработанная	Для монтажа основания
Минископ Держательный кронштейн	NIDA/IRP	Специально разработан	Для монтажа основания
Защитный колпачок минископа	Protolabs	Специально разработан	Для защиты минископа
Моторизованный контроллер	Thorlabs	KMTS50E	Для монтажа основания
NeuView	NIDA/IRP	https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0	Для визуализации in vivo
Офтальмологическая мазь	Puralube Vet Ointment	NDC 17033-211-38	Офтальмологическая
лента из политетрафторэтилена (ПТФЭ)	TegaSeal Лента из ПТФЭ	A-A-58092	Для крепления miniScope к основанию
Стерильный ватный тампон	Puritan	REF 806-WC	Для обеих операций