Визуализация миграции клеток нервного гребня у эмбриона рыбки данио с помощью многофотонной покадровой визуализации

Аннотация

Источник: Уильямс, А. Л., и др. Многофотонная покадровая визуализация для визуализации развития в режиме реального времени: визуализация мигрирующих клеток нервного гребня у эмбрионов рыбок данио. J. Vis. Exp. (2017)

}Это видео демонстрирует протокол многофотонной покадровой визуализации для визуализации миграции клеток нервного гребня в эмбрионе данио-рерио в режиме реального времени с высоким разрешением.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Настройка микроскопа для покадровой съемки

1. Определение настроек лазера

1. Определение длины волны лазера для использования. Используйте длину волны, которая в два раза больше длины волны возбуждения интересующего флуорофора (например, длина волны от 880 до 940 нм для зеленого флуоресцентного белка (GFP).
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании длина волны для GFP была в диапазоне от 880 до 940 нм. Чем выше длина волны, тем ниже выходная мощность лазера.

2. Определение лазерного пропускания. Высокий процент лазерного пропускания убьет эмбрион, используйте самый низкий уровень пропускания (рекомендуется). В течение 24–48 часов покадровых исследований, представленных в настоящем документе, удерживайте передачу на уровне ниже 5%.

3. Определите системы детектирования микроскопа и убедитесь, что установлены правильные фильтры для флуорофора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для многофотонных микроскопов существует несколько систем детектирования с различной чувствительностью излучаемой флуоресценции. Как правило, внутренняя система обнаружения имеет меньшую чувствительность, чем внешняя система обнаружения. Для трансгенных линий с высоким уровнем экспрессии GFP достаточно внутренней системы детектирования. Для трансгенных линий с низкими уровнями экспрессии GFP или с другими флуорофорами (например, красным флуоресцентным белком) может потребоваться внешняя система детектирования для поддержания процента лазерного пропускания на разумном уровне. Независимо от используемой системы обнаружения, должны быть установлены правильные фильтры для флуорофора.

2. Настройка настроек программного обеспечения на многофотонном микроскопе

1. Используя объектив 5X, найдите эмбрион. Вручную поднимите предметный столик в самое высокое положение и с помощью точной фокусировки расположите эмбрион в центре диапазона микроскопа.

2. Вручную опустите сцену и измените объектив 5X на объектив погружения в воду 25X (числовая апертура NA, 0.95). Осторожно поднимите сцену, чтобы вернуть эмбрион в фокус.

3. В программном обеспечении нажмите на режим "xyzt" для получения нескольких изображений через временные интервалы (t) в плоскости x-y на глубине "z". Используйте эпифлуоресцентный или светлопольный вид, чтобы найти глубину резкости в области интереса, которая будет разграничивать Z-стек.

1. В программе нажмите на кнопку "начать"; для этих экспериментов боковой край глаза был началом Z-стека. Нажмите на кнопку "Завершить"; средняя линия эмбриона была концом Z-стека.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер шага составлял 0,3-0,6 мкм, а всего было ~200 шагов для размера z-стека от 60 до 120 мкм).

4. Нажмите на меню для настройки времени сбора данных и частоты съемки.
Для текущей системы ~200 шагов требуют примерно 5 минут для каждого захвата z-стека. Для адекватного восстановления флуорофора и выживания эмбриона необходимо обеспечить соотношение не менее 1:3 между получением z-стека (включение лазерного питания) и временем восстановления (питание лазера выключено).
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, z-стеки регистрируются каждые 20 минут с 5 минутами получения z-стека и 15 минутами восстановления. Для этого протокола можно получить более крупные z-стеки, но это соответствующим образом увеличит время между захватом z-стека, что приведет к меньшему количеству изображений в ходе покадровой съемки.

1. С подходящим временем для восстановления эмбриона, установите время между z-стеками в указанном окне. Задайте общую продолжительность эксперимента в соответствующем окне.

5. Окончательные настройки программного обеспечения, лазера и эмбриона.

1. Включите настройку живого изображения, чтобы внести окончательные корректировки в настройки лазера. Отрегулируйте ползунки лазерного излучения, усиления и смещения в программном обеспечении для оптимизации флуоресцентного изображения. Кроме того, при необходимости корректируйте ориентацию эмбриона в зависимости от продолжительности эксперимента, предполагаемого роста эмбриона и т.д. Убедитесь, что область интереса остается в кадре на протяжении всего эксперимента.

2. Выключите эпифлуоресцентный источник света, так как он больше не нужен во время съемки с интервальной съемкой. Накройте столик лазерным сейфом (Рисунок 1I). При использовании внутренней системы обнаружения лазерный защитный бокс достаточен для защиты от фонового света. Нажмите "start".
ПРИМЕЧАНИЕ: Однако при более чувствительных внешних системах обнаружения лазерный предохранитель не блокирует достаточное количество фонового света, и требуются дополнительные крышки для предотвращения нарушения получения изображения.

2. Во время Time-lapse Acquisition

1. Заполняйте открытую камеру ванны покадровой средой для эмбрионов каждые 8-12 часов (не менее 2 раз в день) во время покадровой съемки через раздвижные дверцы на лазерном сейфе (Рисунок 1I).

2. Прежде чем открывать дверцы лазерного сейфа, убедитесь, что микроскоп не принимает активное изображение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование нагревателей и систем циркуляции сред не обязательно для экспериментов с интервальной съемкой продолжительностью от 24 до 48 часов. Действительно, температуру как столиковых, так и встроенных нагревателей трудно контролировать, и во время получения изображения эмбрион демонстрирует достаточную скорость развития в диапазоне температур от 25-28 °C. Кроме того, системы циркуляционных сред имеют тенденцию к переполнению и потенциальному повреждению оборудования. Таким образом, все эмбрионы обычно проходят стадию после приобретения.

3. Обработка после приобретения

1. В программном обеспечении нажмите на меню «Файл» и выберите «Сохранить».

2. Откройте файл в программе для обработки изображений (см. Таблицу материалов). Выделите правильный ряд изображений. В программном обеспечении выберите меню «Процесс». Нажмите на 3D Deconvolution и нажмите "Apply" для деконволюции каждого z-stack.
ПРИМЕЧАНИЕ: Файл большой; Поэтому этот шаг может занять много часов.

3. В программном обеспечении, в меню "Процесс", нажмите на "максимальная проекция." Нажмите «Применить», чтобы запустить максимальную проекцию для создания 1 изображения на z-стек. Экспортируйте каждый максимально проецируемый файл (1 изображение на z-стек) в формате tiff.

4. Импортируйте отдельные tiff-файлы в программу обработки видео. Выделите все файлы tiff и перетащите их в видеоредактор. Отрегулируйте длину каждого изображения в видео до 0,1 секунды. Экспортируйте видео в формате mov или mp4.

Результаты

Рисунок 1. Настройка. A. Каждый компонент устройства для монтажа эмбриона, включая открытую камеру для ванны, быстросменную платформу и адаптер для сцены. B. Сборка открытой банной камеры. С...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
TC SP5 MP Multi-photon microscope	Leica Microsystems CMS GmbH
Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser	SpectraPhysics
Laser Safety Box	Leica Microsystems CMS GmbH
Leica Application Suite X (LAS X) Программное обеспечение	Leica Microsystems CMS GmbH
Photoshop CS 6 Версия 13.0 x64 Программное обеспечение	Adobe
iMovie версии 10.1.4 Программное обеспечение	Apple
Open Bath Chamber	Warner Instruments	RC-40HP	Высокопрофильный
Быстрый Обменная платформа	Warner Instruments	QE-1	Адаптер
для столиков	35 мм Warner Instruments	SA-20LZ-AL	16,5 x 10 см
Низкоплавкая агароза	ISC Bioexpress	E-3112-25	Сито GeneMate GQA Low MeltAgarose, 25 г
Стеклянные покровные стекла	Fisher	Scientific 12-545-102	Круглая защитная пленка. Диаметр 25 мм
Высоковакуумная смазка	Fisher Научная	трубка 14-635-5C	2,0 фунта. Индекс Доу-CORNINGCORPORATION1658832