Визуализация проекционных паттернов аксонов эмбриональных моторных нейронов у дрозофил

Аннотация

Источник: Чонг, С. Визуализация проекционного паттерна аксонов эмбриональных моторных нейронов у Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует визуализацию проекций аксонов у эмбрионов Drosophila. Иммуномаркировка моторных нейронов, точное препарирование для выявления нейронных структур и дифференциально-интерференционно-контрастная микроскопия в совокупности позволяют выявить детальную архитектуру нейронов, подчеркивая проекционные паттерны аксонов.

Протокол

1. Способ приготовления

1. : Приготовьте 500 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) с раствором t-октилфеноксиэтоксиэтанола (PBT), добавив 0,5 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,5 мл t-октилфеноксиполиэтоксиэтанола (см. Таблицу материалов) до 500 мл 1X PBS и перемешивая не менее 30 мин. Хранить при температуре 4 °C. Использовать в относительно свежем виде и хранить раствор в чистой бутылке.
2. Приготовьте 10 мл 4% параформальдегида, добавив 2,5 мл 16% раствора параформальдегида и 1 мл 10x PBS к 6,5 мл деионизированной воды. Хранить при температуре 4 °C и использовать в течение одной недели.
   ВНИМАНИЕ: Избегайте контакта кожи с раствором параформальдегида, так как он очень токсичен.
3. Получить субстрат 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-Gal) (10% w/v X-Gal в диметилсульфоксиде (ДМСО)) путем растворения 0,1 г субстрата X-Gal на 1 мл ДМСО. Хранить при температуре -20 °C в 100 μл аликвот.
4. Приготовьте окрашивающий раствор X-Gal с использованием 10 мМ фосфатного буфера (pH 7,2), 150 мМ хлорида натрия, NaCl, 1 мМ хлорида магния, MgCl₂, 3 мМ ферроцианида калия, K₄[FeII(CN)₆], 3 мМ феррицианида калия, K₃[FeIII(CN)₆] и 0,3% t-октилфеноксиполиэтоксиэтанола. Хранить при температуре 4 °C в темноте.
5. Приготовьте 3% раствор перекиси водорода, разбавив 30% исходную перекись водорода в соотношении 1:10 с деионизированной водой.
6. Приготовьте раствор 3,3'-диаминобензидина (DAB) путем полного растворения 1 таблетки (10 мг) DAB в 35 мл свежего раствора PBT. Профильтруйте через шприцевой фильтр толщиной 0,2 мкм и храните при температуре -20 °C в 910 мкл аликвот.
   ВНИМАНИЕ: Утилизируйте все отходы DAB в отбеливателе для уничтожения DAB.
7. Сделайте яичные тарелки с яблочным соком. Добавьте в колбу объемом 2 л 35 г агара и 1 л деионизированной воды. Добавьте 33 г сахарозы, 2 г негосепта и 375 мл яблочного сока в колбу объемом 1 л. Растопите их путем автоклавирования в течение 30 минут. Дайте обоим растворам остыть примерно до 60 °C. Соедините и хорошо перемешайте эти растворы, помешивая. Вылейте ~11 мл комбинированного раствора на чашку для культуры 60 мм.
8. Приготовьте дрожжевую пасту, смешав пекарские дрожжи с деионизированной водой (соотношение 1:0,8) и храните при температуре 4 °C.

2. Сбор эмбрионов (день 1)

1. Соберите молодых самок и самцов мух (младше 5 дней) и в течение 1-2 дней держите их в пластиковой клетке для стакана с яйцевой пластиной (60 мм х 15 мм), которая содержит небольшое количество дрожжевой пасты в центре.
2. Для оптимального сбора эмбрионов поздней стадии 16 установите клетку для бутылок с мухами (> 50) около 5 часов вечера и дайте им отложить яйца при температуре 25 °C в течение 3 часов.
3. Переложите мух в бутылку со свежим кормом.
4. Закройте тарелку для яиц крышкой и выдержите ее вверх дном при температуре 25 °C во влажном инкубаторе (влажность ~70%) в течение ночи.

3. Подготовка эмбрионов к иммуноокрашиванию (день 2)

1. Добавьте 1,8 мл раствора PBT в яичную тарелку около 10:20 утра и с помощью ватного тампона отсоедините эмбрионы от пластины, наклоняя ее.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно размяв дрожжевую пасту с помощью ватного тампона, растворите ее в случае, если на ней обнаружено большое количество эмбрионов. Начните сбор эмбрионов за ~40 минут до фиксации (около 11:00 утра).
2. Перенесите эмбрионы из яичной тарелки в микропробирку объемом 1,5 мл с помощью наконечника для пипетки объемом 1 мл.
3. Дайте эмбрионам успокоиться и максимально аспирируйте раствор PBT. Дважды промойте эмбрионы 1 мл раствора PBT. Максимально аспирируйте раствор ПБТ.
4. Заполните пробирку 1 мл 50% отбеливателя (т.е. разбавленного в деионизированной воде) и дехорионируйте эмбрионы, инкубируя их на нутаторе в течение 3 минут при комнатной температуре (RT).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап не убивает дехорионированные эмбрионы.
5. Дайте дехорионированным эмбрионам осесть, максимально аспирируйте 50% отбеливатель и промойте эмбрионы 3 раза 1 мл раствора PBT.
6. Добавьте 0,5 мл гептана и затем добавьте 0,5 мл 4% раствора параформальдегида в пробирку на RT около 11:00 AM.
7. Инкубируйте эмбрионы на орехе в течение 15 минут при RT.
8. Удалите 4% раствор параформальдегида (нижний слой).
9. Добавьте 0,5 мл 100% метанола и девителлинизируйте эмбрионы, энергично встряхивая пробирку в течение 30 с.
10. Удалите гептан (т.е. верхний слой).
11. Добавьте 0,5 мл 100% метанола и энергично встряхивайте пробирку в течение 10 с.
12. Дайте эмбрионам осесть, постукивая по трубке, и максимально аспирируйте метанол. Промойте эмбрионы 1 мл 100% метанола, встряхивая менее 10 с.<бр />ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие метанола разрушает активность β-Gal.
13. Удалите метанол и промойте девителлинизированные эмбрионы 3 раза 1 мл раствора PBT.

4. Генотипирование эмбрионов с помощью окрашивания LacZ (день 2)

1. Добавьте 1 мл раствора PBT в пробирку и инкубируйте пробирку в термоблоке 37 °C или на водяной бане в течение 15 минут.
2. Во время инкубации поместите раствор для окрашивания X-Gal (1 мл на пробирку) при температуре 65 °C на водяную баню до тех пор, пока он не помутнеет. Инкубируйте его на водяной бане при температуре 37 °C.
3. Отсадите раствор PBT и добавьте в пробирку 1 мл красящего раствора X-Gal и 20 μл субстрата X-Gal.
4. Инкубируйте трубку при температуре 37 °C с нутацией до появления синего осадка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации для 2-го и 3-го синих балансиров обычно составляет от 2 до 4 часов.
5. Удалите окрашивающий раствор X-Gal и 3 раза промойте эмбрионы 1 мл раствора RT PBT.
6. С помощью игольчатого зонда или щипцов вручную отсортируйте эмбрионы нужного генотипа (т.е. неокрашенные белые эмбрионы) с помощью светового препарирующего микроскопа (объективы 1,6X-2,5X).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку некоторые синие балансиры, такие как CyO, актин-LacZ и TM3, актин-LacZ, несут трансгенную конструкцию, экспрессирующую бактериальный β-Gal (LacZ) под контролем актина Промоторные, эмбрионы, окрашенные в синий цвет, повсеместно содержат одну или две копии хромосом синего балансика. Таким образом, неокрашенные белые эмбрионы являются гомозиготными по желаемому летальному аллелю.

5. Иммуноокрашивание эмбрионов антителами к антифасциклину II (день 2-3)

1. Соберите и перенесите эмбрионы желаемого генотипа (т.е. неокрашенные белые эмбрионы) в микропробирку объемом 0,5 мл с помощью наконечника для пипетки объемом 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эмбрионы могут быть грубо распределены в соответствии с морфологическими критериями, включая модели сегментации кутикулы и структуры головы и хвоста. Во время инволюции головы, между 10 и 16 ч после откладки яиц, эмбрион подвергается выраженной редукции переднего сегмента.
2. Один раз промойте эмбрионы 0,4 мл раствора PBT и добавьте 0,3 мл блокирующего раствора (5% нормальной козьей сыворотки и 5% ДМСО в растворе PBT).
3. Заблокируйте эмбрионы нутацией в режиме RT на 15 минут.
4. Добавьте 75 мкл антитела к Фасциклину II и инкубируйте пробирку с нутацией при ЛТ в течение ночи.
5. Промойте эмбрионы 4 раза 0,4 мл раствора PBT в течение не менее 20 минут за одну промывку.
6. Добавьте 0,3 мл блокирующего раствора (5% нормальной козьей сыворотки в растворе PBT), содержащего антитела козьей антимышиной пероксидазы хрена (anti-mouse-HRP) (2 мкг/мл) и инкубируйте пробирку с нутацией в режиме ЛТ в течение ночи.
7. Промойте эмбрионы 6 раз 0,4 мл раствора PBT в течение не менее 20 минут за одну промывку.
8. Добавьте 0,3 мл раствора DAB в пробирку.
   ВНИМАНИЕ: Наденьте перчатки и поместите все отходы/пробирки/наконечники DAB в отбеливатель.
9. Добавьте 2 мкл 3% перекиси водорода и инкубируйте пробирку в темноте с нутацией при RT до получения желаемого количества осадка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации для иммуногистохимии 1D4 в целом колеблется от 0,5 до 1 ч.
10. Промойте эмбрионы 4 раза 0,4 мл раствора PBT.
    ВНИМАНИЕ: Удалите раствор DAB и первые два промывания пипеткой и выбросьте их в отбеливатель.
11. Добавьте 0,2 мл монтажного 70% раствора глицерина/PBS в пробирку и храните при RT или 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите пробирку в защищенном от света месте. Более прозрачные препараты можно получить, поместив эмбрионы в 90% раствор глицерина/PBS. Однако препарировать эмбрионы, очищенные в 90% растворе глицерина/PBS, сложнее, чем эмбрионы, очищенные в 70% растворе глицерина/PBS.

6. Стадирование, препарирование, монтирование и визуализация эмбрионов (день 4)

1. Для определения стадии перенесите эмбрионы, уравновешенные 70% глицерином/PBS, на предметное стекло.
2. Соберите эмбрионы поздней стадии 16, у которых нервы межсегментарного нерва (ISN) брюшного сегмента 7 (A7), A8 и A9 сходятся друг с другом и/или имеют среднюю кишку, разделенную на три полосы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы, окрашенные антителом к 1D4, могут быть стадированы на основе проекционных паттернов моторных аксонов ISN и ISNb. После выхода из центральной нервной системы (ЦНС) нервы А7, А8 и А9 ISN эмбрионов поздней стадии 16 сходятся, чтобы соприкасаться друг с другом, а затем расходятся, расширяясь далеко в дорсальные мышцы (стрелка на рисунке 1А). Однако у эмбрионов средней стадии 16 нервы A7 ISN распространяются параллельно с нервами A8/A9 (квадратные скобки на рисунке 1B). Кроме того, проекционные оси нервов A6 ISNb (перпендикулярно вентролатеральным мышцам) в обоих полусегментах примерно выровнены с задним концом пучков продольных аксонов ЦНС (стрелки и линия на рисунке 1C). Эти морфологические критерии варьируются в зависимости от генотипа. В качестве альтернативы, эмбрионы могут быть стадированы на основе морфологии кишечника. До стадии 17 средняя кишка имеет сердцевидную форму, в то время как средняя кишка подразделяется на три полосы к стадии 17.
3. Препарируйте эмбрионы.
   1. Используя шприц объемом 1 мл, вытащите каждый эмбрион из глицериновой капли и поместите эмбрион вентральной лицевой стороной вверх. Отрежьте переднюю часть на 1/4 длины тела и самую заднюю область, свободную от двигательных аксонов.
   2. С помощью игольчатого щупа вытащите вырезанный на конце эмбрион из глицериновой капли, сверните его так, чтобы он был ориентирован тыльной стороной вверх, и поместите горизонтально в поле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда эмбрион выдвигается из глицериновой капли, небольшое количество глицерина, связанного с эмбрионом, делает его липким.
   3. Разрежьте зародыш вдоль дорсальной средней линии с помощью одной очень тонкой вольфрамовой иглы. Сделайте небольшой надрез на заднем конце эмбриона, а затем продолжайте срезать дорсальную среднюю линию по направлению к передней; Резка в обратном направлении также подойдет.
   4. С помощью игольчатого зонда переместите эмбрион по средней линии в каплю глицерина, поместите его тыльной стороной вверх и отделите кишечник от стенки тела, развернув каждую стенку тела в вентролатеральном (диагональном) направлении (объектив в 2,5 раза).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что дорсальная средняя линия полностью разрезана, что приведет к полному разделению между левой и правой стенками тела.
   5. Осторожно извлеките эмбрион по средней линии из капли глицерина, а затем положите два лоскута стенки тела вниз на предметное стекло с помощью тонкого игольчатого зонда (объектив 2,5X).
   6. С помощью очень тонкой вольфрамовой иглы удалите внутренние органы у рассеченного эмбриона, протолкнув их в боковом направлении (объектив 5X).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более подробное описание другой подобной процедуры рассечения можно найти на сайте.
4. Для монтажа добавьте 2-3 мкл 70% раствора глицерина/PBS в чистые препарированные эмбрионы и с помощью тонкоигольчатого зонда перенесите их на новое предметное стекло, на которое в центре нанесено 8 мкл 70% раствора глицерина/PBS (объектив 2,5X).
5. Наденьте покровный лист (18 мм х 18 мм). Заклейте края покровного стекла обычным лаком для ногтей (подойдет прозрачный или цветной).
6. Захватывайте изображения с высоким разрешением (20-кратные, 40-кратные и 63-кратные масляные иммерсионные объективы) под дифференциально-интерференционно-контрастным световым микроскопом (DIC) в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лучшая визуализация и фенотипические характеристики, особенно для аксонов мотора ISNb, могут быть получены с помощью 63-кратного масляного иммерсионного объектива.

Результаты

Рисунок 1: Стадирование эмбрионов на основе проекционных паттернов моторных аксонов ISNи ISNb. (A) У эмбрионов дикого типа поздней стадии 16 нервы A7, A8 и A9 ISN (стрелки) сходятся, чтобы соприкоснуться друг с другом (стреловидный наконе...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бычья сыворотка альбумин	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Раствор параформальдегида	Ted Pella	18505
Хлорид натрия	Sigma-Aldrich	S5886
Хлорид калия	Sigma-Aldrich	P5405
Фосфат натрия двухосновной	Sigma-Aldrich	30435
Фосфат натрия одноосновной	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Субстрат	US Biological	X1000	X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-b-D-галактозид галактопиранозид)
Диметилсульфоксид	Sigma-Aldrich	D4540
Хлорид магния	Sigma-Aldrich	M8266
Тригидрат гексацианоферрата калия(II)	Sigma-Aldrich	P9387
Гексацианоферрат калия(III)	Sigma-Aldrich	244023
Перекись водорода	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-диаминобензидина тетрагидрохлорид	Sigma-Aldrich	D5905
Агар	US Biological	A0930
Сахароза	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (мети 4-гидроксибензоат)	Sigma-Aldrich	H5501
Чашка для культур (60 мм)	Стакан Corning	430166
Tricon	Simport	B700-100	Используется для изготовления пластиковой клетки для стакана для сбора эмбрионов.
Дрожжи	Societe Industrielle Lesaffre Saf	Быстрорастворимые дрожжи Красный
ватный тампон (Деревянный хлопок с одним наконечником PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf tube (1,5 мл)	Sarstedt	#72.690
Отбеливатель	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Метанол	J.T. Baker	UN1230
Нормальная козья сыворотка	Life Technologies	16210-064
Антитело против фасцикулина II	Исследования развития Hybridoma Bank	1D4 анти-Фасциклин II
Козье антитело против мыши-HRP	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 фрагмент козьего антитела к мышам IgG+IgM (H+L)(min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerin	Sigma-Aldrich	G9012
Слайдовое стекло	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 мм
1 мл Шприц	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Вольфрамовая игла	Ted Pella	#27-11	Вольфрамовая проволока, ø0.13мм/6.1м (ø.005"/ 20 футов)
Nutator (Мини твистер)	Korean Science	KO. VS-96TWS	В качестве альтернативы, глиняный нататор марки BD (BD 421125)