Визуализация in vivo мозга личинок данио-рерио для визуализации нейронов мозжечка

Аннотация

Источник: Schramm, P. et al. Визуализация in vivo полностью активной ткани мозга у бодрствующих личинок и молодых особей данио-рерио путем удаления черепа и кожи. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует визуализацию in vivo нейронов мозжечка у трансгенных личинок данио-рерио, которые экспрессируют флуоресцентные белки в нейронах Пуркинье. Процесс включает в себя обезболивание личинок, их обездвиживание в агарозе и тщательное удаление пигментированной кожи для усиления проникновения света и интенсивности флуоресценции. Наконец, подготовленные образцы визуализируются под конфокальным микроскопом для четкой визуализации помеченных нейронов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Анестезия личинок и подготовка к внедрению
   1. Начиная эксперимент в течение дня, перенесите необходимых животных с помощью пластиковой пастеровской пипетки в чашку Петри диаметром 90 мм, которая заполнена либо Данио (для личинок, которые все еще содержатся в чашке Петри с Дано), либо водой из рыбного хозяйства (для личинок, которые старше 7 дней после оплодотворения [dpf] и содержатся в рыбном хозяйстве).
      1. При пипетировании рыбы старше 2 недель, убедитесь, что отверстие пипетки достаточно большое, чтобы не поранить рыбу при их переносе. Не используйте сачок, потому что он физически нанесет вред рыбе, особенно младшим личинкам.
   2. Добавьте подходящую по размеру коловратку или науплии артемий, содержащихся в чашке Петри, чтобы обеспечить свободный доступ к пище и максимальное состояние здоровья личинок и снизить стресс.
   3. Для внедрения перенесите выбранных личинок в чашку Петри диаметром 35 мм, заполненную искусственной спинномозговой жидкостью (АЦСФ). Добавьте необходимый объем d-тубокурарина для достижения рабочей концентрации/эффективной дозы 10 мкМ и подождите несколько минут, пока личинки полностью не будут обездвижены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда рыбы становятся старше или если требуется более быстрая полная анестезия (менее 5 минут), можно увеличить концентрацию d-тубокурарина (LD50 для мышей составляет 0,13 мг/кг внутривенно). Также можно использовать другой анестетик, такой как α-бунгаротоксин (рабочая концентрация: 1 мг/мл), который обладает тем же эффектом, что и кураре, а также поддерживает полную активность мозга. Если для исследуемого субъекта не требуется полностью активный мозг, трикаин в нелетальной дозе (0,02%) также является вариантом для полной анестезии личинок. Однако трикаин блокирует натриевые каналы, тем самым ухудшая мозговую деятельность.
   4. Подготовьте монтажную камеру, взяв крышку чашки Петри диаметром 35 мм, переверните крышку вверх дном и поместите квадратный стеклянный покровный лист (24 x 24 мм) на дно крышки. Схематическое описание этих шагов приведено на рисунке 1 (верхняя часть). Более гладкая поверхность стекла предотвращает соскальзывание агарозного блока, в котором находятся личинки, во время процедуры вскрытия черепа.
   5. Поместите необходимое на день количество ACSF в соответствующий флакон (например, пробирку объемом 50 мл, стакан, бутылочку Шотта и т. д.) и насытьте его карбогеном (5%_CO2, 95%_O2). Если визуализировать только морфологию (например, флуоресцентные паттерны), то ACSF все еще необходим для обеспечения целостности мозга и того, чтобы на клетки не оказывали негативного влияния эффекты осмолярности, но и не требуется оксигенация ACSF. Этот шаг необходимо выполнять только тогда, когда для визуализации необходима полная активность мозга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального насыщения среды кислородом добавьте воздушный камень в конец карбогенной трубки. Чтобы гарантировать достаточно высокий уровень кислорода, необходимо каждые 20-60 минут заменять ACSF в камерах визуализации на свеженасыщенные кислородом ACSF, в зависимости от количества и возраста личинок, внедренных в одну и ту же камеру визуализации (например, для одной внедренной личинки достаточно замены ACSF каждый час). Для шести личинок старше 14 dpf, внедренных параллельно, необходим обмен ACSF каждые 20 мин), поэтому планируйте необходимое количество насыщенных кислородом ACSF в соответствии с планируемым экспериментом.
2. Встраивание личинок
   1. Перенесите полностью обезболенных личинок с помощью пластиковой пипетки Пастера в подготовленную монтажную камеру (в шаге 1.4). Затем осторожно удалите лишнюю среду, чтобы избежать разбавления агарозы с низкой плавкостью (LM). Все следующие шаги следует выполнять под стереомикроскопом с достаточным увеличением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наклон монтажной камеры может помочь полностью удалить носитель.
   2. Немедленно приступайте к следующему шагу, добавив достаточно большую LM-агарозную каплю поверх личинок (около 1 мл, в зависимости от размера личинок), чтобы защитить животных от пересыхания и уменьшить ненужный стресс.
   3. Сориентируйте личинки в нужном положении до того, как агароза застынет. Следите за тем, чтобы спинная часть личинок была направлена вверх. Кроме того, убедитесь, что личинки внедряются как можно ближе к поверхности агарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера и количества личинок, планируемых к одновременному внедрению, можно регулировать концентрацию агарозы. Например, для 1-3 личинок возрастом 30 dpf рекомендуется концентрация 1,8%-2% LM-агарозы. Для 1-4 личинок возрастом 7 dpf наиболее целесообразно использовать 2,5% LM-агарозы, тогда как для 5-8 личинок больше подходит 2%. Если требуется полностью активный мозг, рекомендуется внедрять только трех рыб одновременно, чтобы сократить время, необходимое для работы личинок. В целом, рекомендуется использовать более низкие концентрации (1,8%-2%), чем старше становятся личинки или тем больше личинок планируется внедрить одновременно.
   4. Если изображения записываются с помощью перевернутого микроскопа, обрежьте агарозный блок, содержащий личинок, в небольшую кубовидную форму. Это важно для переноса личинок в камеру визуализации в дальнейшем. При использовании вертикального микроскопа такая обрезка не требуется, потому что монтажная камера также может использоваться в качестве камеры для визуализации. На рисунке 1 (верхняя часть) приведено схематическое описание этих шагов.
3. Обнажение мозга
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги следует выполнять с максимальной осторожностью, чтобы не навредить личинкам излишне. Если для эксперимента требуется полностью активный мозг, имейте в виду, что с каждой секундой, пока рыба еще полностью окутана агарозой и имеет открытый череп без насыщенного кислородом АКСФ, мозг будет страдать от недостатка кислорода и пересыхать. Последствия дефицита кислорода будут становиться тем более драматичными, чем старше будут внедренные личинки. Поэтому важно провести операцию не только в кратчайшие сроки, но и с максимальной точностью, чтобы избежать механического повреждения головного мозга иглой. Шаги 3.2-3.4 не должны занимать более 30 с на одну рыбу при дрессировке.
4. Начинайте операцию, как только агароза застынет. Во-первых, отрежьте весь избыток агарозы над интересующей областью мозга, чтобы получить свободный доступ к голове и свободное рабочее пространство. Если спинная часть головы уже торчит из агарозы, пропустите этот шаг.
5. В зависимости от области интереса, выберите место для начала операции. Возьмите стеклянную иглу и сделайте небольшой разрез через кожу, не проникая слишком глубоко в ткани. Это будет отправной точкой для отслаивания покрывающей кожи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов никогда не начинайте непосредственно над интересующей областью, чтобы снизить риск повреждения важных структур. При необходимости можно начать сзади к заднему мозгу и продвигаться вперед до тех пор, пока нежелательный участок кожи не будет отслаиваться.
6. Продолжайте делать очень маленькие надрезы вдоль части кожи, стремясь удалить, едва перемещая иглу прямо под поверхностью. В большинстве случаев нет необходимости полностью перемещаться вокруг мозга и вырезать круглый кусок кожи и черепа, а достаточно сделать два разреза вдоль головы, а затем отодвигать кожу в одну или другую сторону. На рисунке 2 показано схематическое изображение оптимальной стратегии разреза для получения свободного доступа к мозжечку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта микрохирургия является деликатной процедурой, и, скорее всего, потребуется некоторая тренировка для идеального удаления кожи без повреждения основного мозга. Также рекомендуется найти оптимальную стратегию резки для интересующей области мозга и придерживаться ее на протяжении всего эксперимента.
7. Сразу после снятия кожи со всех внедренных личинок полейте агарозу (насыщенную кислородом) ACSF, чтобы удалить нежелательные частицы кожи и крови, сохранить мозг полностью активным и защитить его от высыхания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если для эксперимента необходим здоровый мозг, рекомендуется ловить максимум трех рыб одновременно.
8. Если вы используете вертикальный микроскоп, начните непосредственно с визуализации.
   1. При использовании инвертированного микроскопа просуньте небольшой шпатель под кубовидный агарозный блок (шаг 2.4).
   2. Добавьте небольшую каплю LM-агарозы на дно камеры визуализации (например, чашки со стеклянным дном) и сразу же переверните шпателем агарозный блок, содержащий личинки, на 180° и осторожно прижмите его ко дну камеры визуализации, в то время как жидкая агарозная капля действует как клей.
   3. Когда агароза затвердеет, заполните камеру визуализации (насыщенным кислородом) ACSF, затем начните визуализацию. Описание схемы приведено на рисунке 1 (нижняя часть).
9. Когда для эксперимента требуется полная активность мозга, всегда следите за тем, чтобы ACSF в камере визуализации имел достаточно высокий уровень кислорода. Чтобы обеспечить это, среду следует осторожно заменять на свеженасыщенную кислородом ACSF каждые 20-60 минут (в зависимости от количества и размера рыбы, размера и поверхности камеры визуализации, а также продолжительности визуализации).

Результаты

Рисунок 1: Схематическая процедура подготовки данио-рерио с открытым черепом к визуализации in vivo. Рабочие инструкции для различных этапов можно найти на самом рисунке. Графика разработана Флорианом...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп	Leica	TCS SP8
d-Tubocurare	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
Стеклянный капилляр типа 1	WPI	1B150F-4
Стеклянный капиллярный тип 2	Гарвардский аппарат	GC100F-10
Стеклянный покровный колпак	deltalab	D102424
Камера для визуализации	Ibidi	81156
LM-Agarose	Condalab	8050.55
Микроскоп Камера	Leica	DFC9000 GTC
Needle-Puller тип 1	NARISHIGE	модель PC-10
Иглосъемник тип 2	Инструменты Sutter Модель	P-2000
Пастер-пипетки 3мл	A.Hartenstein	20170718
Tricain	Sigma-Aldrich	E10521-50G
35 мм чашка Петри	Sarstedt	833900
90 мм чашка Петри	Sarstedt	821473001