Характеристика механических свойств тканей головного мозга мышей с помощью атомно-силовой микроскопии

Аннотация

Источник: Canovic, E. P., et al. Характеристика многомасштабных механических свойств ткани головного мозга с помощью атомно-силовой микроскопии, ударного индентирования и реометрии. J. Vis. Exp. (2016)

Это видео демонстрирует использование атомно-силовой микроскопии (АСМ) для измерения вязкоупругих свойств ткани мозга, где кантилевер со сферическим зондом взаимодействует с тканью и изгибается под действием приложенных сил. Лазерный луч, отраженный на детекторе, отслеживает консоль для измерения глубины вдавливания и силы релаксации, что позволяет охарактеризовать механические свойства ткани.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Индентирование с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ)

1. Приготовьте чашки Петри диаметром 60 мм (P60) с биоклеем, полученным из мидий, в соответствии с инструкциями производителя.
   1. Приготовьте запас нейтрального буферного раствора, состоящего из 0,1 М гидрокарбоната натрия в стерильной воде с оптимальным pH 8,0. Отфильтруйте и стерилизуйте (0,2 микрона) буфер бикарбоната натрия и храните его при температуре 4 °C.
   2. В колпаке с ламинарным потоком смешайте раствор 6,25% биоадгезивного вещества, полученного из мидий, и 3,125% гидроксида натрия (NaOH) в буфере из бикарбоната натрия.
   3. Нанесите пипеткой 100 мкл раствора биоадгезивного раствора на чашку Петри диаметром 60 мм (P60) и с помощью наконечника пипетки распределите раствор по кругу диаметром 3-5 см.
   4. Оставьте посуду P60 открытой в колпаке с ламинарным потоком и дайте раствору высохнуть (~30 минут). Мойте посуду 1 раз фосфатно-солевым буфером (PBS) и 2 раза стерильной водой. Дайте посуде высохнуть на воздухе в вытяжке с ламинарным потоком и храните ее в герметичном пластиковом пакете при температуре 4 °C до 1 месяца.
2. Откалибруйте АСМ и установите образец мозга в АСМ. ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям по калибровке AFM в соответствии с инструкциями производителя.
   1. Осторожно загрузите в держатель зонда зонд АСМ с номинальной пружинной постоянной 0,03 Н/м и боросиликатным шариком диаметром 20 мкм.
   2. Откалибруйте постоянную пружины и обратную чувствительность оптического рычага (InvOLS) консольного АСМ методом тепловой настройки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После расчета постоянной пружины для датчика АСМ она должна оставаться постоянной при повторном использовании. Тем не менее, консольный InvOLS необходимо будет повторно калибровать каждый раз при перенастройке лазера с консолью. Кроме того, калибровка должна быть выполнена на подложке на несколько порядков жестче консоли, такой как полистирол.
   3. Включите нагреватель, установленный на сцене, и установите температуру на 37 °C.
   4. Установите срез мозга на тарелку P60.
      1. Аккуратно насыпьте кусочек мозга толщиной 350 мкм и независимую от углекислого газа (CO₂) среду из колбы с круглым дном в чашку P60, покрытую биоклеем, полученным из мидий.
      2. Расположите срез мозга в центре тарелки P60, осторожно наклонив его. При необходимости медленно пипеткой наберите среду из ручной пипетки, чтобы развернуть срез мозга, который сложился сам на себя, или еще лучше расположите срез мозга в центре чашки.
      3. Осторожно удалите излишки среды с помощью пипетки P1000 (не используйте пылесос).
      4. Накройте чашку P60 крышкой и дайте срезу мозга прилипнуть в течение 20 минут.
   5. Снимите головку AFM, поместите срез мозга, установленный в чашке P60, на столик AFM и добавьте ~2 мл предварительно подогретой CO₂-независимой среды.
   6. Осторожно добавьте каплю среды на зонд АСМ, чтобы защитить его от разрушения из-за поверхностного натяжения при опускании в среду, окружающую срез мозга.
   7. Переместите головку АСМ на сцену и начните опускать головку до тех пор, пока она не будет погружена в среду.
   8. Используя камеру с помощью ПЗС-матрицы с видом сверху, переместите лазер на консоль.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расположение лазера на кантилевере будет немного изменено из-за разницы в показателе преломления воздуха и среды.
   9. Подождите 5 минут, пока консоль отреагирует на погружение в теплую жидкость, затем сбросьте юстировку зеркала до свободного отклонения 0 В.
   10. Запустите тепловой спектр на датчике AFM в соответствии с инструкциями производителя. Используйте аппроксимацию первого теплового пика для пересчета InvOLS зонда АСМ в среде.
   11. С помощью оптического микроскопа переместите предметный столик образца так, чтобы интересующая область мозга оказалась ниже зонда АСМ. ПРИМЕЧАНИЕ: Мозолистое тело будет казаться темным, так как оно более непрозрачно, чем окружающее серое вещество. Кора головного мозга находится выше мозолистого тела.
   12. Сбросьте юстировку зеркала до свободного отклонения 0 В.
   13. На измерителе суммы и отклонения в программном обеспечении АСМ нажмите "Включить", чтобы включить головку АСМ.
   14. С помощью регулятора положения на головке АСМ опустите головку до тех пор, пока не произойдет контакт между кантилевером и образцом.
3. Проводите эксперименты по соблюдению ползучести.
   1. Постройте функцию приложенной силы в редакторе функций программного обеспечения. Функция силы состоит из нарастания в 0,1 секунды до заданного значения 5 нН и удержания его в течение 20 секунд, за которым следует замедление в течение 1 секунды до приложенной силы 0 нН.
      1. На мастер-панели отступов в разделе «Метод отступа» выберите «Загрузить» для режима индентора, «N» для единиц измерения и «Редактор функций» для функции индентора.
      2. В редакторе функций на панели «Сегмент Парм» создайте сегмент функции прикладной силы, который начинается на 0 нН и заканчивается на 5 нН, со временем 0,1 с. Нажмите «Вставить -->».
      3. Для следующего сегмента установите начало на 5 нН, конец на 5 нН, а время на 20 с. Нажмите "Вставить -->."
      4. Для последнего сегмента установите начало на 5 нН, конец на 0 нН, а время на 1 сек. Затем нажмите «Рисовать» и закройте окно «Редактор функций».
   2. На вкладке "Сила" мастер-панели установите флажок "индентор рампа после срабатывания" и установите функцию приложенной силы на срабатывание после достижения точки срабатывания 0,1 В.
   3. Нажмите "Одиночная сила" в нижней части вкладки "Сила" мастер-панели, что приведет к срабатыванию сконструированной приложенной силовой функции для податливости ползучести.
   4. После того, как однократное усилие вдавливания будет завершено, поднимите головку АСМ так, чтобы она не соприкасалась с образцом. Затем снова зацепите головку и обнулите свободный прогиб.
   5. Переместите предметный столик образца для определения местоположения новой области интереса и опустите головку АСМ для установления контакта. ПРИМЕЧАНИЕ: Головка АСМ должна быть отведена от поверхности образца при перемещении предметного столика. Невыполнение этого требования может привести к повреждению хрупкой консоли AFM.
   6. Повторяйте шаги до тех пор, пока не будет собран нужный объем данных.
4. Проводите эксперименты по силовой релаксации.
   1. Создайте прикладную функцию отступов в редакторе функций программного обеспечения. Функция отступа состоит из 0,1-секундного нарастания до заданного значения 3 мкм и удержания его в течение 20 с, за которым следует 1-секундное нарастание вниз до глубины отступа 0 мкм.
      1. На мастер-панели отступов в разделе метод отступа выберите "Отступ" для режима индентора, "m" для единиц измерения и "Function editor" для функции Indenter.
      2. В редакторе функций на панели "Сегмент Парм" создайте сегмент функции прикладной силы, который начинается с 0 мкм и заканчивается на 3 мкм, с временем 0,1 с. Нажмите "Вставить -->".
      3. Для следующего сегмента установите начало на 3 μм, конец на 3 μм, а время на 20 сек. Нажмите «Вставить -->».
      4. Для конечного сегмента установите начальную частоту 3 μм, концевую — на 0 μм, а время — на 1 секунду. Затем нажмите «Рисовать» и закройте окно «Редактор функций».
   2. На вкладке "Сила" мастер-панели установите флажок "индентор рампа после срабатывания" и установите приложенную силовую функцию на срабатывание после достижения точки срабатывания 0,1 В.
   3. Нажмите "Одиночная сила" в нижней части вкладки "Сила" мастер-панели, чтобы активировать созданную функцию вдавливания для ослабления силы.
   4. После того, как одноусилие вдавливания будет завершено, поднимите головку АСМ так, чтобы она не соприкасалась с образцом, затем снова зацепите головку и снова обнулите прогиб.
   5. Измените положение предметного столика, чтобы определить новую область интереса, и опустите голову, чтобы установить контакт.
   6. Повторяйте оба измерения, пока не будет собран желаемый объем данных.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Hibernate-A medium	Gibco	A1247501	CO 2-независимая нейронная среда для тканей взрослого
человека Атомно-силовой микроскоп, MFP-3D-BIO	Asylum Research	-
нагреватель чашек Петри	Asylum Research	-
АСМ зонд, 0,03 Н/м, радиус 10 мкм боросиликатная сфера	Novascan	PT.
Cell-Tak	Corning	354240	Биоадгезив, полученный из мидий
бикарбонат натрия	Sigma-Aldrich	S5761	Альтернативные поставщики могут быть использованы
Гидроксид натрия, 1N	Sigma-Aldrich	59223C	Альтернативные поставщики могут быть использованы

GS,