Лазерная абляция с индуктивно связанной плазмой-масс-спектрометрией для визуализации металлов в тканях мозга мыши

Аннотация

Источник: Хэйр, Д. Дж., et.al. Визуализация металлов в тканях головного мозга с помощью лазерной абляции - индуктивно связанной плазмы - масс-спектрометрии (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует использование лазерной абляции-индуктивно связанной плазмы-масс-спектрометрии (LA-ICP-MS) для визуализации и количественной оценки распределения металлов в тканях мозга мышей. Протокол включает в себя лазерную абляцию для получения аэрозоля из частиц образца, ионизацию частиц в высокотемпературной плазме и масс-спектрометрию для разделения ионов по соотношению массы к заряду. Затем специализированное программное обеспечение используется для создания количественных изображений, выявляющих пространственное распределение металлов в ткани.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Подготовка LA-ICP-MS к анализу

1. Поместите эталоны и образцы в абляционную камеру, убедившись, что они находятся в пределах глубины резкости ПЗС-камеры, установленной на устройстве LA. Если необходимо настроить прибор, включите подходящий справочный материал (, например, NIST 612 Trace Elements in Glass). Затяните пальцами два винта на дверце камеры, чтобы закрыть камеру абляции.
2. В программном обеспечении ICP-MS выберите открытие клапана газа аргона в разделе «Техническое обслуживание» или аналогичной панели и установите расход газа-носителя на 1,2 л мин^-1 в соответствующем диалоговом окне.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе в качестве газа-носителя используется аргон. В некоторых примерах в качестве газа-носителя используется либо гелий, либо смесь гелия и аргона.
3. В программном обеспечении LA нажмите кнопку «Продувка», чтобы промыть ячейку газообразным аргоном в течение как минимум 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время продувки можно изменить, нажав кнопку «время продувки» или аналогичную кнопку. При использовании системы абляции с двухобъемной абляционной камерой периодически перемещайте ступень в каждый угол и диагонально перемещайте ячейку, чтобы обеспечить удаление как можно большего количества остаточного воздуха из ячейки. Этого можно достичь, выбрав «домашние этапы» или эквивалентную функцию.
4. Включите ИСП-МС, нажав кнопку «Плазма вкл» и дайте прогреться в течение двух часов, в течение которых можно выполнить шаги 1,5 - 2,4. Настройки прибора зависят от производителя.
5. Репрезентативная абляция стандартов тканей
   1. Выберите инструмент «Линия» и проведите одну линию абляции длиной примерно 3 мм поперек поверхности ткани.
   2. Установите параметры следующим образом, щелкнув правой кнопкой мыши по строке абляции в списке экспериментов и изменив следующие параметры: диаметр луча (выбран пользователем по мере необходимости; здесь используется квадратный луч размером 30 мкм), скорость сканирования (в 4 раза больше диаметра луча в секунду; 120 мкм с^-1) и флюенс энергии (0,3 -0,5 Дж см^-2 для мягких тканей; при необходимости оптимизируйте для более твердых матриц). При толщине ткани 30 мкм лазерный луч не проникает во всю толщину этой ткани, устраняя любые потенциальные загрязнения из подложки микроскопа. Нормализация к углероду может быть использована для коррекции вариаций количества абляции ткани. Установите эти параметры по умолчанию для каждой последующей строки, выбрав переключатель «по умолчанию».
   3. Продублируйте эту линию шесть раз, выделив начальную линию, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав «Дублировать сканы». Убедитесь, что линии смещены по оси x- или y- на диаметр луча. Это дает в общей сложности семь линий на стандарт, удаленных друг от друга в соответствии с диаметром луча.
   4. Повторите шаги 1.5.1 - 1.5.3 для каждого стандарта, обеспечив одинаковую длину линии.
6. Чтобы нарисовать область абляции над образцом, следуйте одному из двух следующих методов:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что для линий образца используются одни и те же параметры сканирования (диаметр луча, скорость сканирования, флюенс энергии).
   1. Если система LA оснащена широким полем зрения, выберите инструмент «Линия» и проведите линию от верхнего левого угла образца достаточно длинной, чтобы покрыть образец в самой широкой точке, используя те же параметры лазера, которые описаны в 1.5. Продублируйте этот скан, как описано в 1.5.3, с линиями, расположенными в соответствии с диаметром луча, столько раз, сколько необходимо, чтобы обеспечить полное покрытие образца.
   2. Если широкое поле зрения недоступно, определите и запишите координаты x и y} (обычно отображаются на главном экране как «позиция на сцене» или что-то подобное), соответствующие углам прямоугольника, охватывающего весь образец. Используйте эти координаты для размещения параллельных линий абляции, охватывающих всю область образца.
   3. Нарисуйте линии для прерывистого сканирования стандартов не позднее чем через ~20 часов сканирования образца, повторив процесс, описанный в 1.5. В зависимости от продолжительности сканирования образца это может потребоваться несколько раз. Завершите эксперимент дополнительным сканированием стандартов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При определении координат x и y во время очистки ячейки, выбор исходных положений и связанная с этим калибровка оси изменят ранее полученные особенности для координат x и y, тогда как разница (т.е. длина линии) не будет затронута.

2. Настройка методов сбора данных для ICP-MS

1. Для стандартной линии абляции разделите длину линии на скорость лазерного сканирования, чтобы определить общее время анализа для одной линии. Повторите это для линии образца.
2. В программном обеспечении ICP-MS создайте новый метод (показанный здесь как «пакет») и убедитесь, что выбран «анализ с временным разрешением» или его эквивалент. Выберите значения m/z, которые должны быть обнаружены, а затем отрегулируйте время интегрирования для каждого m/z так, чтобы общее время интегрирования за один цикл было равно 0,25 с. Нажмите «Сохранить пакет как» и назовите соответствующее имя (, например, Std1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку образец будет проходить через лазерный луч со скоростью, в четыре раза превышающей диаметр луча, это гарантирует, что для каждой массы будет записана точка данных, эквивалентная диаметру луча. Например, при использовании пятна размером 100 мкм скорость сканирования 400 мкм с^-1 со временем интегрирования 0,25 с позволит получить изображения с истинными размерами в пикселях. Время интеграции можно регулировать для повышения чувствительности; При увеличении времени интегрирования до 0,33 с скорость сканирования должна быть снижена до трехкратного диаметра луча.
3. Для стандартов введите время анализа для каждого сканирования линии в соответствующее поле, а также дополнительные 15 с для учета времени лазерного прогрева и промывки. Введите образец списка прогонов (т.е. в порядке выполнения сканирования) с тем же количеством сборов (обычно пронумерованных последовательно; т.е. 001, 002, и т.д.) как общее количество стандартных линий.
4. Для выборки продублируйте метод, используемый для стандартов, сохранив текущий метод или пакет с альтернативным именем файла, и настройте общее время сбора данных (включая дополнительные 15 секунд) и общее количество сборов в соответствии с количеством строк, которые будут абнулировать выборку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку большинство систем LA-ICP-MS используют односторонний запуск (LA запускает ICP-MS), важно, чтобы программное обеспечение ICP-MS ожидало запуска от LA до начала следующей линии абляции. В окне регистрации ICP-MS будет указано «ожидание запуска».

3. Запуск эксперимента

1. Запустите очередь ICP-MS, добавив первый метод или пакет в очередь, и убедитесь, что программное обеспечение ожидает запуска от системы LA.
2. В программном обеспечении LA включите источник питания лазера, нажав «излучение», нажмите «запустить» и установите время прогрева лазера 10 с и время промывки 20 с в соответствующих полях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот перерасход гарантирует, что ICP-MS будет готов начать сбор новых данных, когда лазер начинает каждую последующую линию абляции.
3. Запустите лазерную последовательность, нажав кнопку «Пуск». При использовании двухобъемной ячейки убедитесь, что чашка для образца находится на месте.

4. Расчет количественных стандартов

ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько вариантов преобразования данных ICP-MS в изображения. К ним относятся использование самодельных программных инструментов, написанных на языках с открытым исходным кодом, коммерческих макросов и программного обеспечения для анализа данных. Здесь используется недавно разработанный программный плагин, основанный на специализированном пакете анализа данных LA-ICP-MS.

1. Перенесите все пакетные папки, содержащие данные о прогоне (001.d, 002.d, etc.) на отдельный компьютер с установленным программным обеспечением для анализа. Извлеките файлы данных *.csv для каждой строки пакета в отдельную папку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется использовать скрипт для автоматического переноса *.csv файлов в новую папку. Более подробную информацию см. в прилагаемом коде Python. Этот сценарий был написан для Agilent серии 7700 или 8800 ICP-MS, но может быть отредактирован в соответствии с выходным файлом других производителей.
2. Откройте программную платформу и последовательно следуйте за вкладками, чтобы импортировать и проанализировать стандарты для создания количественных изображений, как описано ниже.
3. Чтобы импортировать данные из первого стандартного пакета, выберите «Agilent .csv» в поле «Тип файла», «Вся папка» в поле «Тип импорта» и убедитесь, что формат «Дата» идентичен формату компьютера. Нажмите «Импорт», выберите папку, содержащую .csv-файлы для первого набора стандартов, и перейдите на вкладку «Базовые показатели».
4. Вычитание базовых показателей
   1. Используйте вкладку «Автоматический выбор» (команда 2) из главного выпадающего меню приложения на панели инструментов, выберите «Информация из импорта» и нажмите «Продолжить».
   2. Нажмите «Выбрать все» и выберите «Baseline_1» для интеграции.
   3. Чтобы выбрать первые 10 секунд каждой линии сканирования (соответствующие времени лазерного прогрева), обрежьте данные, введя вторые значения «0» и «(продолжительность линии - 10 с)», и нажмите «Добавить интеграции» (, например, для линии сканирования 35 секунд введите значения «0» и «25»).
5. Чтобы выбрать данные образца, используйте вкладку «Автоматический выбор», как описано в разделе 4.4, но выберите «Output_1» в качестве интеграции. Обрезайте данные с начала и конца каждой стандартной строки, чтобы исключить фоновый сигнал (, например, для строки сканирования 35 с, введите значения '13' и '4').
6. Чтобы исключить падения сигнала, вызванные возможными дырами в стандартах, во вкладке «Сэмплы» нажмите «Каналы» в левом верхнем углу области графика, чтобы выбрать канал с высоким соотношением сигнал/шум (, например, C13 или P31). Запишите любые резкие падения сигнала и выберите значение CPS, достаточно низкое, которое ниже нормального изменения в выборках, но достаточно высокое, чтобы выделить резкие падения сигнала.
7. Перейдите на вкладку «DRS» и выберите «Baseline_Subtract» для «Текущей схемы сокращения объема данных». Выберите канал из 4.6 для 'Index Channel' и значение CPS для 'Threshold to use when masking low signals'. Вставьте значение <0,5 с для параметра «Секунды для обрезки до/после низких сигналов», чтобы учесть задержку передачи сигнала от лазера к ICP-MS.
8. Чтобы убедиться в адекватной маскировке областей с низким сигналом, вернитесь на вкладку «Сэмплы» и выберите обработанную (e.g., Fe56_CPS) трассировку канала. При необходимости повторите и уточните значения CPS и «Секунды для обрезки до/после низких сигналов», как указано в 4.7.
9. Перейдите на вкладку «Результаты» и выберите «Экспорт данных» в главном выпадающем меню приложения. Введите имя файла, чтобы создать файл данных электронной таблицы с результатами (e., вычисления Std1, Std2...).
10. Откройте файл данных в подходящей программе для работы с электронными таблицами и рассчитайте значения CPS для каждого отдельного канала, который необходимо количественно оценить. Используйте заданные концентрации металлов из распыления раствора ICP-MS для расчета коэффициента пересчета значений CPS в ppm (μг г⁻¹) для каждого количественного элемента.
11. Повторите шаги 4.3 - 4.10 для всех наборов стандартов в выполнении.

5. Построение количественных изображений

1. Напишите 'Biolite()' в командной строке, чтобы открыть программу.
2. Импортируйте образцы данных, нажав «Загрузить изображения» и выбрав папку, содержащую .csv-файлы для образца изображения.
3. Коррекция фона
   1. Нажмите на вкладку "Базовые линии", чтобы применить коррекцию фона для образца. На изображении фосфора (P31), появившемся на экране, выделите области фона с помощью инструмента рисования прямоугольником. При выборе как можно большего числа областей создается карта дрейфа сигнала/плазмы в масштабах всего изображения, чтобы обеспечить адекватную компенсацию этих искажающих факторов.
   2. Чтобы сделать фоновый сигнал более заметным, выберите инструмент редактирования графика (вверху слева от отображаемого изображения) и щелкните правой кнопкой мыши по изображению. Выберите «Изменить внешний вид изображения» и измените «Первый цвет на Z=» на большое отрицательное значение (e.g. -100,000). Далее, нажав «Готово».
4. Перейдите на вкладку «Стандарты», чтобы открыть таблицу поправочных коэффициентов CPS/ppm. Введите значения, рассчитанные по стандартам, на шаге 4.10 для каждого из элементов. Этот шаг поможет скорректировать дрейф чувствительности в ICP-MS. Нажмите «Начать!»
5. Откройте «Браузер данных» на вкладке «Данные», которая содержит изображения для каждого элемента и каждого шага.
6. Чтобы завершить работу над изображением для экспорта, выберите нужное изображение в папке 'StdCorrImages', щелкните правой кнопкой мыши по имени изображения (*_ppm) и нажмите 'NewImage'. Щелкните правой кнопкой мыши изображение, чтобы открыть «Изменить внешний вид изображения», чтобы выбрать желаемую таблицу цветов и цветовую шкалу. Добавьте цветовую шкалу к изображению, щелкнув правой кнопкой мыши по изображению и выбрав «Добавить аннотацию». Выберите «Цветовая шкала» в верхнем левом выпадающем меню и используйте вкладки для изменения желаемой цветовой шкалы.
7. Чтобы экспортировать изображение, убедитесь, что изображение, о котором идет речь, и перейдите на вкладку «Файл» и нажмите «Сохранить графику...». Выберите нужный формат и сохраните изображение. Кроме того, выбранное изображение можно перенести с помощью инструментов копирования и вставки.
8. Повторите шаги 5.6 и 5.7 для всех интересующих изображений.
9. Количественная оценка дискретных областей
   1. Чтобы активировать инструменты ROI, перейдите на вкладку «Анализ», «Пакеты» и выберите «Обработка изображений».
   2. Выберите нужное изображение и перейдите на вкладку «Изображение» и нажмите «ROI...». Нажмите «Начать отрисовку ROI» и с помощью инструмента рисования выберите интересующую область в образце. Чтобы завершить рисование, нажмите «Завершить ROI».
   3. Чтобы получить статистику по выбранному ROI, перейдите на вкладку «Изображение» и нажмите «Статистика...».
   4. Скопируйте и вставьте результаты в отдельную таблицу. Повторите выбор ROI (5.9.2) для всех регионов и интересующих элементов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Предметные стекла для содового стекла	n/a	n/a	Типичные предметные стекла подходят для всех экспериментов
Система лазерной абляции NWR213	ESI Ltd	n/a	Используется в этих экспериментах. Другие подходящие производители могут потребовать внесения изменений в протокол
Agilent серии 8800 ICP-MS	Agilent Technologies	n/a	Используется в этих экспериментах. Другие подходящие производители могут потребовать внесения изменений в протокол
Iolite	Iolite Software	n/a	Доступно в http://iolite-software.com/. Другие методы доступны, см. протокол
Excel	Microsoft	n/a	}
IGOR Pro	Волновые метрики	n/a	Доступно от https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm