Визуализация генерации второй гармоники на модели крысы для изучения дефектов тубулина

Аннотация

Источник: Piazza, V., et al., Безметочная нелинейная оптика для изучения тубулин-зависимых дефектов в центральном миелине. J. Vis. Exp. (2023)

Это видео демонстрирует процедуру визуализации аномалий микротрубочек в срезе ткани мозга крысы с помощью микроскопа с двухфотонным возбуждением. Он использует сигналы генерации второй гармоники (ГВГ) для обнаружения дефектов тубулина и снижения выработки миелина.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Перенесите в микроскоп

1. Если микроскоп находится в другой комнате, подготовьте изолированную коробку с подогретыми гелевыми пакетами для переноса срезов тканей с сохранением температуры. Коробка также будет сохранять секции теплыми до тех пор, пока они не будут изображены.
2. Поместите образец под микроскоп и убедитесь, что он правильно расположен под объективом, наблюдая за ним через окуляры с проходящим светом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы выровнять предсказанные излучающие структуры с направлением колебаний лазера, чтобы максимизировать излучаемый (и, следовательно, обнаруживаемый) сигнал генерации второй гармоники (ГВГ).
3. Удалите излишки HBSS так, чтобы тонкая жидкая пленка покрыла весь образец. Визуально проверяйте жидкую пленку каждые несколько минут, чтобы избежать чрезмерного испарения и высыхания образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В описанных условиях, секция используется не более 20 минут. Сушка образца приводит к радикальным артефактным эффектам (Рисунок 1A). Если требуется более длительное время визуализации, рекомендуется периодическое замачивание среза в теплой, свежей среде, а не добавление большего количества HBSS. Использование перфузионных камер и клея или легкоплавкой агарозы для иммобилизации ткани также рекомендуется, когда необходимо провести более длительные эксперименты.
4. Подготовьте предметный столик микроскопа для получения изображений без сканирования, что может включать в себя закрытие всех дверей темной инкубационной камеры или накрытие инкубационной камеры тканью с черным нейлоновым полиуретановым покрытием.

2. Визуализация

1. Выберите режим визуализации "без сканирования" вдоль пути передачи. Таким образом, будет оптимизирован захват слабого сигнала SH тубулина.
2. Выберите цель LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
3. Установите мощность лазера в диапазоне от 13 мВт до 26 мВт с временем задержки пикселя 12,6 μс. Делайте снимки размером не более 512 x 512 пикселей, со скоростью 5 и средним значением 2, со средним временем получения около 15 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование более высокой мощности лазера и/или более длительное время выдержки может повредить образец (Рисунок 1B).
4. Сначала сделайте снимки с помощью фильтра коротких частот 485 нм (SP485), а на втором шаге добавьте резкий полосовой фильтр с длиной волны 405 нм (BP405; Рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Псевдосветлопольные изображения могут быть получены через тот же детектор с использованием остаточного лазерного света видимой линии (лазеры 405 нм или 488 нм работают лучше всего).

Результаты

Рисунок 1: Примеры артефактов. (A) Артефакт из-за высыхания образца. (B) Артефакт из-за чрезмерного воздействия. Масштабные линейки: 30 мкм.

Материалы