Покадровая конфокальная визуализация динамики нейрональных дендритов в эксплантах сетчатки мышей

Аннотация

Источник: Ing-Esteves, S. & Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetic Targeted Retinal Cell Populations. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует использование конфокальной микроскопии для визуализации дендритной динамики в живых эксплантах сетчатки мышей. В нем описаны шаги по стабилизации сетчатки под конфокальным микроскопом, выполнению эпифлуоресцентной визуализации для визуализации амакриновых интернейронов со вспышкой звездообразования и захвату 3D-изображений с интервальной съемкой для мониторинга изменений в морфологии амакриновых дендритов.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Покадровая конфокальная визуализация живых препаратов сетчатки целиком Соберите

1. инкубационную камеру для вертикального конфокального микроскопа, как показано на рисунке 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для инвертированных конфокальных систем плоские крепления помещаются ганглиозными клетками сетчатки (РГК) стороной вниз непосредственно на стеклянное нижнее покровное стекло инкубационной камеры. Как только сетчатка соприкоснется с покровным стеклом, ее нельзя будет перемещать.
2. Заполните камеру насыщенной кислородом искусственной спинномозговой жидкостью (АКСН) и включите насос и регулятор температуры (температура 32-34 °С, расход 1 мл/мин). Не допускайте повышения температуры выше 34 °C.
3. Чтобы перенести плоское крепление сетчатки в перфузионную камеру, остановите насос и удалите ХКБ, который находится в камере. Поместите диск со смешанным эфиром целлюлозы (MCE) с плоской оболочкой для сетчатки в (пустую) инкубационную камеру.
4. Поместите груз для образца на плоское крепление; предварительно намочите груз, чтобы нарушить поверхностное натяжение. Снова наполните камеру подогретым аКСФ и циркулируйте ФКСФ со скоростью ~1 мл/мин.
5. Поместите револьвер с 25-кратным объективом для погружения в воду (числовая апертура 0,95) в камеру визуализации. Скрининг помеченных клеток с помощью эпифлуоресцентного света (рис. 1C).
6. Отрегулируйте объем изображения, чтобы зафиксировать интересующие дендритные особенности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании была зафиксирована полная дендритная древка с разрешением 1024 x 1024 пикселей на кадр, z-шагом 1 мкм и частотой кадров 2 минуты между каждым z-стеком. Итоговые размеры изображений составляют ~100 μм x 100 μм x 20 μм.
7. Чтобы настроить мощность лазера до оптимальной настройки, используйте таблицу поиска, которая определяет как перенасыщенные, так и недонасыщенные пиксели. Во время сканирования отрегулируйте мощность лазера таким образом, чтобы пиксели не были перенасыщены (т. е. с интенсивностью 255 или выше). Продолжайте визуализацию до тех пор, пока не произойдет значительное и заметное снижение флуоресцентного сигнала и увеличение шума (обычно 2-4 часа).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется снизить мощность лазера, так как алгоритмы деконволюции работают оптимально, когда пиксели распределены по всему динамическому диапазону. Интенсивность пикселей не должна превышать 254; Эмпирический анализ нейритов показал, что значения пикселей ниже 170 являются идеальными для деконволюции. Высокая скорость сканирования (400-600 Гц) с усреднением строк (2-3) предпочтительнее одиночных, более медленных сканирований с тем же общим временем задержки пикселей. Область длительной визуализации часто обесцвечивается, но другие участки экспланта остаются жизнеспособными. Можно визуализировать несколько областей в плоском монтировании, каждая в течение 2-4 часов, с общим временем инкубации 6 часов. Сеансы визуализации продолжительностью более 6 ч не подвергались систематическому тестированию. Деградация нейритов и блеббинг являются признаками того, что жизнеспособность экспланта снижается.

Результаты

Рисунок 1: Конфигурация инкубационной камеры для визуализации живых клеток. (A) Инкубационный аппарат для визуализации в реальном времени, показывающий компоненты нагрева, раствора и визуализации. Двойной нагреватель включает в себя платформу...

Материалы