Визуализация и количественная оценка регенерации аксонов в аксотомизированных ганглиозных нейронах сетчатки крысы

Аннотация

Источник: Portela-Lomba, M., et. al. Кокультура аксотомизированных ганглиозных нейронов сетчатки сетчатки крысы с обонятельной оболочечной оболочкой, как in vitro модель регенерации аксонов взрослого человека. J. vis. exp. (2020).

В этом видео демонстрируется визуализация и количественная оценка регенерации аксонов в аксотомизированных ганглиозных нейронах сетчатки сетчатки крысы (ОРГ), совместно культивируемых с иммортализированными клетками глии, обоняющей обоняние человека. ГН имеют иммунометку, с красными сомами и зелеными аксонами. Изображения были получены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, а процент нейронов с аксоном и индексом регенерации аксонов был количественно определен с помощью программного обеспечения для визуализации.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Культура обонятельной оболочки человека (ihOEG, Ts12 и Ts14)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура проводится в стерильных условиях в шкафу биобезопасности для культуры тканей.

1. Приготовьте 50 мл питательной среды ME10 OEG.
2. Приготовьте 5 мл модифицированной среды Dulbecco Modified Eagle Medium или DMEM/F12-фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) в конической пробирке объемом 15 мл.
3. Нагрейте обе среды при температуре 37 °C на водяной бане в течение 15 минут.
4. Разморозьте флаконы с ячейками Ts12 и Ts14 при 37 °C на чистой водяной бане.
5. Ресуспендируйте и добавьте клетки в культуральную среду DMEM/F12-FBS, приготовленную на этапе 2.
6. Центрифугируйте в течение 5 минут при 200 x g.
7. Притягивайте надосадочную жидкость.
8. Добавьте 500 μL среды ME10 и повторно суспендируйте гранулу.
9. Приготовьте чашку для клеточной культуры p60 с 3 мл ME10 и добавьте клеточную суспензию по каплям.
10. Двигайтесь, чтобы равномерно распределить ячейки по пластине.
11. Культивирование клеток при 37 °C в 5% CO₂.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После достижения слияния, по крайней мере, еще один проход должен быть сделан для оптимизации клеток для кокультуры. Необходимо 90% слияние, прежде чем засевать их на покровные листы для кокультуры. Слияние p-60 имеет среднее число клеток 7 x 10⁵} для Ts14 и 2,5 x 10⁶ для клеточных линий Ts12. Клеточные линии Ts12 и Ts14 следует пропускать каждые 2–3 дня.

2. Подготовка ihOEG (Ts12 и Ts14) для анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен за 24 часа до рассечения ганглиозных нейронов сетчатки (ГН) и кокультуры.

1. Обработайте покровные стекла Ø 12 мм поли-L-лизином (ФАПЧ) 10 мкг/мл в течение 1 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Покровные стекла можно оставить на ночь в растворе ФАПЧ.
2. Промойте покровные стекла 1x фосфатным буферным солевым раствором (PBS) три раза.
3. Отделите клетки Ts12 и Ts14 ihOEG от чашки для культивирования клеток p60.
   1. Добавьте 4 мл питательной среды DMEM/F12-FBS в коническую пробирку объемом 15 мл. Нагрейте до 37 °C на чистой водяной бане.
   2. Удалите среду из планшетов и промойте клетки один раз 1 мл 1x PBS-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
   3. Добавьте 1 мл трипсина-ЭДТА в клетки OEG и инкубируйте в течение 3–5 минут при 37 °C, 5% CO₂.
   4. Соберите клетки с помощью пипетки p1000 и перенесите их в среду, приготовленную на шаге 3.1.
   5. Центрифугируйте в течение 5 мин при 200 x g.
   6. Аспирируйте надосадочную жидкость.
   7. Добавьте 1 мл среды ME10 и повторно суспендируйте гранулу.
   8. Посчитайте количество клеток в гемоцитометре.
4. Засейте 80 000 клеток Ts14 или 100 000 клеток Ts12 в лунку на покровные стекла в 24-луночных планшетах в 500 мкл среды ME10.
5. Культивирование клеток при 37 °C в 5% CO₂ в течение 24 ч.

3. Диссекция ткани сетчатки

ПРИМЕЧАНИЕ: 2-месячные самцы крыс Вистар используются в качестве источника ГН. Две сетчатки (одна крыса) на 20 лунок 24-луночной клеточной чашки. Автоклавный хирургический материал перед использованием. Набор для диссоциации Папаина приобретается коммерчески (Таблица материалов). Следуйте инструкциям поставщика услуг по восстановлению. Восстановите D, L-2-амино-5-фосфоновалеровую кислоту (APV) в бульоне 5 мМ и приготовьте аликвоты.

1. В день проведения анализа приготовьте следующие среды.
   1. Приготовьте чашку для клеточной культуры p60 с 5 мл холодного сбалансированного раствора соли Эрла или EBSS (флакон 1 из набора для диссоциации папаина).
   2. Приготовьте чашку для клеточной культуры p60 с восстановленным флаконом 2 (папаином) из набора для диссоциации папаина плюс 50 мкл APV. Затем добавьте 250 мкл восстановленного флакона 3 (ДНКаза плюс 5 мкл APV).
   3. В стерильной пробирке смешать 2,7 мл флакона 1 с 300 мкл флакона 4 (ингибитор альбумин-овомукоидной протеазы). Добавьте 150 мкл флакона 3 (ДНКазы) плюс 30 мкл APV.
   4. Приготовьте 20 мл среды Нейробазал-В27 (NB-B27).
2. Принесите в жертву крысу путем удушения CO₂.
3. Удалить голову путем обезглавливания с помощью гильотины; поместите его в чашку Петри диаметром 100 мм и распылите на голову 70% этанола, прежде чем поместить ее в колпак с ламинарным потоком.
4. Обрежьте крысиные усы ножницами, чтобы они не мешали манипуляции с глазами.
5. Захватите зрительный нерв щипцами, чтобы вытащить глазное яблоко настолько, чтобы можно было сделать разрез поперек глаза с помощью скальпеля.
6. Удалите хрусталик и стекловидное тело и вытяните сетчатку (оранжевую ткань), в то время как остальные слои глаза останутся внутри (включая слой пигментного эпителия).
7. Поместите сетчатку в чашку для клеточных культур p60, приготовленную на шаге 3.1.1.
8. Перенесите сетчатку в чашку для клеточных культур p60, приготовленную на шаге 3.1.2, и разрежьте ее скальпелем на мелкие кусочки размером примерно < 1 мм.
9. Переложите в пластиковую пробирку объемом 15 мл.
10. Инкубируйте ткань в течение 30 минут в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C при 5% CO₂, перемешивая каждые 10 минут.
11. Диссоциируйте клеточные комки путем пипетирования вверх и вниз с помощью стеклянной пипетки Пастера.
12. Центрифугируйте клеточную суспензию при 200 x g в течение 5 мин.
13. Выбросьте надосадочную жидкость и, чтобы инактивировать папаин, повторно суспендируйте клеточную гранулу в растворе, приготовленном на шаге 3.1.3. (1,5 мл на 2 глаза).
14. Осторожно пипетируйте эту клеточную суспензию в 5 мл восстановленного флакона 4.
15. Центрифугируйте при 200 x g в течение 5 мин.
16. Во время центрифугирования полностью удалите среду ME-10 из 24-луночного клеточного планшета OEG (предварительно подготовленного на шаге 2) и замените его 500 мкл среды NB-B27 на лунку.
17. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 2 мл среды NB-B27.
18. Нанесите 100 мкл суспензии клеток сетчатки на лунку пластины m24 на обработанные ФАПЧ или OEG монослои-покровные стекла.
19. Поддерживайте культуры при температуре 37 °C с 5% CO₂ в течение 96 часов в среде NB-B27.

4. Иммуноокрашивание

1. Через 96 ч зафиксировать клетки на 10 мин, добавив тот же объем 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS в питательную среду (600 μL) (конечная концентрация PFA 2%).
2. Удалите среду и PFA с 24-луночного планшета и еще раз добавьте 500 мкл 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS. Инкубировать в течение 10 мин.
3. Выбросьте фиксатор и промойте 3 раза 1x PBS в течение 5 мин.
4. Заблокируйте 0,1% Triton X-100/1% FBS в PBS (PBS-TS) на 30–40 мин.
5. Приготовьте первичные антитела в буфере PBS-TS следующим образом: SMI31 (против белков MAP1B и NF-H) моноклональное антитело (1:500). 514 (распознает белки MAP2A и B) кроличья поликлональная антисыворотка (1:400).
6. Добавьте первичные антитела к кокультурам и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
7. На следующий день выбросьте антитела и промойте покровные стекла 1x PBS, 3 раза, в течение 5 минут.
8. Подготовьте вторичные антитела в буфере PBS-TS следующим образом: Для SMI-31, антимышиный Alexa Fluor 488 (1:500). Для 514, анти-кролик Alexa-594 (1:500).
9. Инкубируйте клетки с соответствующими флуоресцентными вторичными антителами в течение 1 ч, при комнатной температуре или RT в темноте.
10. Постирайте покровные стекла 1x PBS, 3 раза, в течение 5 минут, в темноте.
11. Наконец, установите покровные стекла с монтажной средой (Таблица материалов) и поддерживайте их при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости можно провести окрашивание флуоресцентных ядер DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол). Перед установкой инкубируйте клетки в течение 10 минут в темноте с DAPI (10 мкг/мл в 1x PBS). Промойте покровные стекла 3 раза с помощью 1x PBS и, наконец, установите покровные стекла с помощью монтажного носителя.

5. Количественная оценка регенерации аксонов

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы количественно оцениваются с помощью 40-кратного объектива эпифлуоресцентного микроскопа. Должно быть сделано не менее 30 снимков на случайных полях, содержащих не менее 200 нейронов, которые должны быть количественно определены для каждого лечения. Каждый эксперимент следует повторять минимум три раза.

1. Количественно оценить процент нейронов с аксоном (SMI31 положительным нейритом) по отношению к общей популяции ГН (идентифицированных с MAP2A/B 514 положительным иммуноокрашиванием нейронального тела и дендритов).
2. Количественно оцените индекс регенерации аксонов или среднюю длину аксонов (мкм/нейрон). Этот параметр определяется как сумма длин (в мкм) всех идентифицированных аксонов, деленная на общее количество подсчитанных нейронов, независимо от того, представляли они аксон или нет. Длина аксонов определяется с помощью плагина NeuronJ программы обработки изображений ImageJ (NIH-США).
3. Рассчитайте среднее значение, стандартное отклонение и статистическую значимость с помощью соответствующего программного обеспечения.

Материалы