Визуализация и количественная оценка регенерации аксонов в аксотомизированных ганглиозных нейронах сетчатки крысы

Аннотация

Источник: Portela-Lomba, M., et. al. Кокультура аксотомизированных ганглиозных нейронов сетчатки сетчатки крысы с обонятельной оболочечной оболочкой, как in vitro модель регенерации аксонов взрослого человека. J. vis. exp. (2020).

В этом видео демонстрируется визуализация и количественная оценка регенерации аксонов в аксотомизированных ганглиозных нейронах сетчатки сетчатки крысы (ОРГ), совместно культивируемых с иммортализированными клетками глии, обоняющей обоняние человека. ГН имеют иммунометку, с красными сомами и зелеными аксонами. Изображения были получены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, а процент нейронов с аксоном и индексом регенерации аксонов был количественно определен с помощью программного обеспечения для визуализации.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Культура обонятельной оболочки человека (ihOEG, Ts12 и Ts14)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура проводится в стерильных условиях в шкафу биобезопасности для культуры тканей.

1. Приготовьте 50 мл питательной среды ME10 OEG.
2. Приготовьте 5 мл модифицированной среды Dulbecco Modified Eagle Medium или DMEM/F12-фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) в конической пробирке объемом 15 мл.
3. Нагрейте обе среды при температуре 37 °C на водяной бане в течение 15 минут.
4. Разморозьте фл....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антитело 514	Ссылка 34		Поликлональная антисыворотка кролика, которая распознает MAP2A и B.
Антитело SMI-31	BioLegend	801601	Моноклональное антитело против белков MAP1B и NF-H
Антитело Anti-mouse Alexa Fluor 488	Антитело ThermoFisher	A-21202
Anti-rabbit Alexa Fluor 594 антитело	ThermoFisher	A-21207
B-27 Добавка	Gibco	17504044
D,L-2-амино-5-фосфоновалеровая кислота	Sigma	283967	Ингибитор NMDA-рецепторов
DAPI	Sigma	D9542	Ядра флуоресцентного окрашивания
DMEM-F12	Gibco	11320033	Среда для культивирования клеток
FBS	Gibco	11573397	Фетальная бычья сыворотка
FBS-Hyclone	Fisher Scientific	16291082	Фетальная бычья сыворотка
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01	Монтажная среда
ImageJ	Национальные институты здравоохранения (NIH-США)		Программное обеспечение для визуализации
L-глутамин	Lonza	BE17-605F
Нейробазальная среда	Gibco	21103049	Питательная среда для нейрональных клеток
Система диссоциации папаина	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	Для использования в нейронных клетках изоляция
PBS	Домашнее
PBS-EDTA	Lonza	H3BE02-017F
Пенициллин/Стрептомицин/Амфотерицин B	Lonza	17-745E	Бактериостатический и бактерицидный
экстракт гипофиза	Gibco	13028014	гипофиза крупного рогатого скота
Поли-L-лизин (PLL)	Sigma	A-003-M

экстракт