Визуализация клеток с помощью флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением

Abstract

Источник: Daniele, F., et. al TIRFM и pH-чувствительные GFP-зонды для оценки динамики везикул нейротрансмиттеров в клетках нейробластомы SH-SY5Y: визуализация клеток и анализ данных. J. vis. exp. (2015).

В этом видео демонстрируется визуализация клеток нейробластомы человека с помощью микроскопа с полным внутренним отражением (TIRF) для визуализации синаптических везикул, помеченных флуорофорами. Сначала клетки фокусируются в эпифлуоресцентном режиме. Затем вносятся коррективы для достижения полного внутреннего отражения, генерируя затухающие волны, которые избирательно возбуждают флуорофоры вблизи мембраны. Перед формированием изображений TIRF настраиваются параметры сбора данных и устанавливается частота дискретизации.

Protocol

1. Клеточная культура и трансфекция

1. SH-SY5Y клеточная культура
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты проводились с использованием нейробластомы человека SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266). Клетки SH-SY5Y растут как смесь плавающих кластеров и адгезивных клеток. Следуйте инструкциям, указанным в протоколе (плотность клеток, коэффициент расщепления и т. д.), чтобы клетки, которые растут, прочно прикреплялись к стеклянной крышке, что имеет решающее значение для флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRFM).
   1. Перед началом под шкафом биобезопасности с ламинарным потоком сделайте подходящий объем стерильного раствора фосфатного буферного раствора (PBS) и питательной среды.
      1. Сделайте 50 мл PBS с концентрацией 150 мМ хлорида натрия (NaCl), 24 мМ фосфатного буфера, pH 7,4. Отфильтруйте раствор.
      2. Приготовьте 50 мл клеточной среды из модифицированной Eagle среды (DMEM) Дульбекко с высоким содержанием глюкозы, 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина (100 ЕД/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), L-глутамина (2 мМ) и пирувата натрия (1 мМ). Отфильтруйте раствор.
   2. Удалите всю питательную среду и промойте клетки 3 мл PBS.
   3. Инкубируйте клетки с 2 мл 0,05% трипсин-этилендиамитетрауксусной кислоты (ЭДТА) (для чашки Петри 6 см) в течение 5 мин при 37 °C, 5%_CO2 и отделите клетки с помощью пипетки.
   4. Инактивируйте трипсин, добавив 2 мл DMEM, и соберите клетки центрифугированием при 300 x g в течение 5 минут.
   5. Удалите надосадочную жидкость, добавьте в гранулу 1 мл DMEM и пипеткой распыляйте раствор вверх и вниз достаточно, чтобы клетки диспергировались в одноклеточную суспензию.
   6. Разделите их в соотношении 1:4 в новой чашке Петри диаметром 6 см, содержащей 3 мл готовой среды. Поддерживайте клетки в культуре в чашках Петри диаметром 6 см при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_CO2. Субкультуры раз в неделю, или когда они покроют 80 - 90% площади поверхности.
2. Покрытие ячеек SH-SY5Y для визуализации
   1. Для экспериментов TIRFM пластинчатые ячейки размещаются на стеклянных крышках. Используйте стеклянные крышки толщиной от 0,17 ± 0,005 мм и показателем преломления 1,5255 ± 0,00015. Прежде чем начать, подготовьте стеклянные покровные стекла следующим образом:
      1. Очистите стеклянные крышки 90% этанолом на ночь (O/N).
      2. Тщательно промойте их в дистиллированной воде (три смены дистиллированной воды). Высушите стеклянные крышки в сушильном шкафу.
      3. Поместите крышки в стеклянные чашки Петри и стерилизуйте в разогретой духовке при 200 °C в течение 3 часов.
   2. За день до трансфекции поместите каждый покровный листок в чашку Петри 3,5 см, добавьте 1 мл питательной среды и инкубируйте при 37 °С в инкубаторе с 5% содержанием_СО2.
   3. Трипсинизируйте клетки, как описано в шагах 1.1.3 - 1.1.5, суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл готовой среды и подсчитайте. Рассчитайте правильный объем клеточной суспензии для добавления в каждую чашку Петри, чтобы получить 3 x 10⁵ клеток на лунку. Такая плотность необходима для оптимального роста клеток и эффективной трансфекции. Инкубировать при 37 °C в инкубаторе с 5%_CO2 O/N.
3. SH-SY5Ytransfection полиэтиленимином (PEI)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации динамики синаптических везикул был использован вектор pCB6, содержащий синапто-pHluorin. Синапто-pHluorin был получен путем внутрикадрового слияния pH-чувствительного варианта зеленого флуоресцентного белка (GFP) и белка везикулярной мембраны синаптобревина 2. Эта конструкция широко используется для исследования свойств синаптических везикул в нейронах.
   1. Перед началом трансфекции сделайте 10 мл следующих растворов. Храните растворы не более 1 месяца.
      1. Создайте решение NaCl на 150 мМ. Отрегулируйте pH до 5,5 с помощью 0,01 Н соляной кислоты (HCl).
      2. Приготовьте раствор PEI в концентрации 10% полиэтиленимина (PEI; линейный 25 кДа) в 150 мМ растворе NaCl. pH раствора повышается до 8,8. Отрегулируйте pH до 7,8 с помощью 0,01 Н HCl.
   2. Через 24 часа после нанесения средства удалите средство и освежите 1,5 мл готового средства. Держите клетки при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_CO2.
   3. Под ламинарным проточным шкафом биобезопасности, в пробирку с микрофугой объемом 1,5 мл, добавьте 3 мкг плазмидной ДНК на 25 мкл 150 мМ раствора NaCl и 100 мкл раствора PEI на 3,5 см чашки Петри.
   4. Сделайте вихрь в течение 10 секунд, затем инкубируйте смесь ДНК/ПЭИ в течение 30 минут при комнатной температуре (RT).
   5. Осторожно добавьте смесь ДНК/ПЭИ в чашку Петри, содержащую покровные листы с клетками, и осторожно встряхните, чтобы равномерно распределить реагент в чашке Петри.
   6. Через 4 ч смените среду и инкубируйте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием_CO2. Эксперименты с визуализацией проводят через 24 - 48 ч после трансфекции.

2. Визуализация клеток с помощью настройки TIRFM

1. Imaging up-up
   1. Выполните визуализацию TIRF с настройкой, описанной на рисунке 1. Он состоит из моторизованного инвертированного микроскопа (рис. 1, врезка А), источника лазера (рис. 1, врезка В) и ползунка TIRF (рис. 1, врезка С). Достигайте освещенности TIRFM через высокую числовую апертуру (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) 100X масляный, иммерсионный объектив.
   2. Для подсветки TIRFM используйте многолинейный (458/488/514 нм) аргон-ионный лазер мощностью 100 мВт. Используя мономодовое волокно, введите линейно поляризованный лазерный свет в траекторию луча с помощью ползунка TIRF. Вставьте ползунок TIRF в плоскость диафрагмы светового поля пути отраженного светового луча.
      1. Для широкоугольного освещения подключите микроскоп к обычной ртутной короткодуговой лампе HBO белого света. Двойная призма с сохранением поляризации в ползунке обеспечивает одновременное сочетание освещения TIRF и белого света.
   3. Фильтруйте лазерный свет с помощью возбуждающего фильтра (полоса пропускания 488/10 нм), установленного на фильтрующем колесе и введенного в лазерный тракт. Используйте высокоскоростной затвор с программным управлением, чтобы обеспечить быстрое управление лазерной подсветкой. Для анализа pHluorin установите полосовой фильтр излучения 525/50 нм. Снимайте цифровые изображения (512 x 512 пикселей) на охлаждаемую быструю ПЗС-камеру с помощью программного обеспечения Image ProPlus.
2. Достижение освещения TIRF (Рисунок 2)
   1. Включите лазеры, компьютер, камеру, колесо фильтров и контроллеры затвора; затем подождите 20 минут перед началом эксперимента, так как лазеры должны нагреться и стабилизироваться.
   2. Перед проведением визуализации сделайте подходящий объем следующих растворов.
      1. Приготовьте 50 мл раствора Кребса (KRH) с 125 мМ NaCl, 5 мМ хлорида калия (KCl), 1,2 мМ сульфата магния (MgSO₄), 1,2 мМ дигидрофосфата калия (KH₂PO₄), 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил) пиперазина-1-этанессульфоновой кислоты (HEPES) (буферизованного до pH 7,4), 2 мМ хлорида кальция (CaCl₂) и 6 мМ глюкозы.
      2. Приготовьте 10 мл раствора KCl-KRH (pH 7,4) при концентрации 80 мМ NaCl, 50 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO₄, 1,2 мМ KH₂PO₄, 25 мМ HEPES (буферизованных до pH 7,4), 2 мМ CaCl₂ и 6 мМ глюкозы.
   3. Снимите стеклянную крышку с трансфицированными клетками и вставьте ее в соответствующую камеру визуализации. Соберите камеру и добавьте 500 μл раствора KRH в центр стакана.
   4. Добавьте масло поверх цели. Поместите камеру визуализации на предметное столико микроскопа и расположите объектив под стеклянным покровным стеклом. Накройте образец крышкой сейфа.
   5. В режиме эпифлуоресценции сосредоточьтесь на покровном стекле (верхней поверхности) и выберите трансфицированные клетки, размещенные в центре камеры. Выберите ячейки, флуоресцентный сигнал которых может быть четко зарегистрирован при времени экспозиции менее 80 мс.
   6. Под программным управлением переключитесь на подсветку TIRF в режиме реального времени.
   7. Чтобы задать конфигурацию TIRF, проверьте положение луча, выходящего из объектива, на крышке образца (рис. 2B). Когда луч расположен в центре линзы объектива (рис. 2A, слева), в центре крышки образца TIRF виднеется пятно (рис. 2B, слева), и ячейка визуализируется в режиме эпифлуоресценции (несколько фокусных плоскостей, высокая фоновая флуоресценция; Рисунок 2C, слева).
   8. Чтобы достичь критического угла, переместите сфокусированное пятно в направлении Y (вперед или назад; Рисунок 2B, в центре) с помощью винта регулировки угла наклона на ползунке TIRF (рисунок 1C). Когда луч сходится на плоскости образца под углом, превышающим критический угол (рис. 2A, справа), пятно исчезает, и в середине крышки образца видна прямая тонкая сфокусированная линия (рис. 2B, справа).
   9. Для точной настройки угла TIRF используйте образец ячейки (рисунок 2C). Посмотрите флуоресцентное изображение на видео. На этом этапе все еще видно эпифлуоресцентное изображение. Осторожно перемещайте винт до тех пор, пока не будет достигнуто условие TIRF: в фокусе находится только одна оптическая плоскость клетки (т.е. плазматическая мембрана, контактирующая с покровным стеклом). В результате получается плоское изображение с высокой контрастностью (рис. 2C, справа).
3. Пример визуализации
   1. Установите эксперимент с одноканальной интервальной съемкой. Чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание, сделайте снимок с малым временем экспозиции и высоким коэффициентом усиления. Соответствующее время экспозиции составляет от 40 до 80 мс. Получение изображений с частотой дискретизации 1–2 Гц. Кинетика везикул может быть лучше оценена при выборке на более высокой частоте (10 Гц). Обычное время наблюдения обычно составляет 2 минуты.

Results

Рисунок 1. Настройка микроскопа TIRF. Схематический вид и изображение (врезка) микроскопа TIRF. Установка включает в себя моторизованный инвертированный микроскоп Axio Observer Z1 (A), многолинейный аргон-ионный лазер мощностью 100 мВт (B) ...

Materials