$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Визуализация экзоцитарных событий с помощью флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRF)
Примечание: Для этого протокола требуется специализированное оборудование для микроскопии, включая камеру для поддержания температуры, влажности и углекислого газа (CO2), микроскоп с инвертированным флуоресцентным внутренним отражением (TIRF), оснащенный эпифлуоресцентным освещением, объектив TIRF с большим увеличением и высокой числовой апертурой (NA), автоматизированный XYZ. и детектор чувствительного устройства с зарядовой связью (ПЗС). В этом протоколе используется полностью автоматизированный инвертированный микроскоп, оснащенный объективом TIRF 100x 1,49 NA, твердотельным лазером с длиной волны 491 нм и ПЗС-матрицей, умножающей электроны (EM-CCD). Все оборудование управляется с помощью программного обеспечения для визуализации и лазерного управления. Перед началом протокола визуализации включите климатическую камеру, сцену, лампу, компьютер и камеру.
- Выберите объектив в программном обеспечении для обработки изображений. Как только объектив будет на месте, закрепите обогреватель объектива вокруг воротника.
- Убедитесь, что цель полностью опущена, прежде чем закрепить инкубатор сцены в слоте сцены. Равномерно налейте дистиллированную воду на входные отверстия инкубатора ступени, чтобы предотвратить разливы.
- Включите систему инкубации. Откройте клапан бака CO2 и убедитесь, что давление соответствует требованиям системы в соответствии с инструкциями производителя. Дайте камере некоторое время, чтобы температура достигла 5%CO2 и 37 °C. Перед добавлением чашки для визуализации поместите пустую чашку в инкубатор, чтобы избежать конденсации воды на объективе.
- Питание от источника лазерного излучения.
- Откройте сценический инкубатор и добавьте в объектив погружное масло. Поместите образец в инкубатор и стабилизируйте его с помощью устойчивых рычагов или груза чашки. Поднимайте объектив до тех пор, пока масло не соприкоснется со дном образца. Переключитесь на проходящее световое освещение и найдите фокальную плоскость нейронов через окуляры.
- Запустите программное обеспечение для лазера и подключите его к программному обеспечению для управления лазером. Установите освещение на широкопольное и выберите объектив (рекомендуется 100x 1.49 NA TIRF). Установите показатель преломления образца (ячейки ~1,38). Отрегулируйте интенсивность лазера, сняв галочку с "TTL" (транзисторно-транзисторная логика) для лазера 491 нм. Установите ползунок на 100, затем уменьшите его до значения от 20% до 40%. Снова установите флажок "TTL".
- Снова сфокусируйтесь на образце при освещении проходящим светом. Перейдите в программное обеспечение для обработки изображений, выберите лазерную подсветку 491 нм и откройте затвор. Точно отрегулируйте точку фокусировки лазера на потолке и центрируйте ее по центру диафрагмы с закрытым полем при снятом конденсаторе. Поместите конденсор вверх дном на оптическую скамью, чтобы не поцарапать объектив.
- Замените конденсатор, перейдите в программное обеспечение TIRF и установите глубину проникновения (PD) на 110 нм. Затем переключитесь с широкоугольного освещения на режим освещения TIRF для получения изображения.
- Найдите клетки, экспрессирующие флуорин, связанные с везикулами, связанные с мембранным белком 2 (VAMP2), через окуляры с помощью широкопольной эпифлуоресценции с эпифлуоресцентным источником света.
- Отрегулируйте параметры визуализации (время экспозиции, усиление и мощность лазера) для максимизации отношения сигнал/шум и динамического диапазона, используя минимальное время экспозиции и интенсивность лазера для уменьшения фотообесцвечивания и фототоксичности (например, экспозиция от 50 до 100 мс, с усилением от 15 до 30 при максимальной мощности лазера 30%).
- Установите непрерывный автофокус на ячейку. Получение набора таймлапс-изображений с захватом каждые 0,5 секунды в течение 5 минут. Для стимулированного состояния нетрина-1 добавьте 500 нг/мл нетрина-1 в чашку с клетками в ламинарном проточном колпаке и верните чашку в инкубатор на 1 час перед визуализацией.