Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения для визуализации экзоцитарных событий

Аннотация

Источник: Winkle, C. C., et al. Использование комбинированных методологий для определения роли доставки плазматических мембран во время ветвления аксонов и морфогенеза нейронов. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео демонстрируется флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF) для визуализации экзоцитарных событий в корковых нейронах. pH-чувствительный маркер зеленого флуоресцентного белка (GFP) флуоресцирует при слиянии везикул, при этом селективное возбуждение TIRF захватывает проксимальный экзоцитоз мембраны при покадровой визуализации.

Протокол

1. Визуализация экзоцитарных событий с помощью флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRF)

Примечание: Для этого протокола требуется специализированное оборудование для микроскопии, включая камеру для поддержания температуры, влажности и углекислого газа (CO₂), микроскоп с инвертированным флуоресцентным внутренним отражением (TIRF), оснащенный эпифлуоресцентным освещением, объектив TIRF с большим увеличением и высокой числовой апертурой (NA), автоматизированный XYZ. и детектор чувствительного устройства с зарядовой связью (ПЗС). В этом протоколе используется полностью автоматизированный инвертированный микроскоп, оснащенный объективом TIRF 100x 1,49 NA, твердотельным лазером с длиной волны 491 нм и ПЗС-матрицей, умножающей электроны (EM-CCD). Все оборудование управляется с помощью программного обеспечения для визуализации и лазерного управления. Перед началом протокола визуализации включите климатическую камеру, сцену, лампу, компьютер и камеру.

1. Выберите объектив в программном обеспечении для обработки изображений. Как только объектив будет на месте, закрепите обогреватель объектива вокруг воротника.
2. Убедитесь, что цель полностью опущена, прежде чем закрепить инкубатор сцены в слоте сцены. Равномерно налейте дистиллированную воду на входные отверстия инкубатора ступени, чтобы предотвратить разливы.
3. Включите систему инкубации. Откройте клапан бака CO₂ и убедитесь, что давление соответствует требованиям системы в соответствии с инструкциями производителя. Дайте камере некоторое время, чтобы температура достигла 5%_CO2 и 37 °C. Перед добавлением чашки для визуализации поместите пустую чашку в инкубатор, чтобы избежать конденсации воды на объективе.
4. Питание от источника лазерного излучения.
5. Откройте сценический инкубатор и добавьте в объектив погружное масло. Поместите образец в инкубатор и стабилизируйте его с помощью устойчивых рычагов или груза чашки. Поднимайте объектив до тех пор, пока масло не соприкоснется со дном образца. Переключитесь на проходящее световое освещение и найдите фокальную плоскость нейронов через окуляры.
6. Запустите программное обеспечение для лазера и подключите его к программному обеспечению для управления лазером. Установите освещение на широкопольное и выберите объектив (рекомендуется 100x 1.49 NA TIRF). Установите показатель преломления образца (ячейки ~1,38). Отрегулируйте интенсивность лазера, сняв галочку с "TTL" (транзисторно-транзисторная логика) для лазера 491 нм. Установите ползунок на 100, затем уменьшите его до значения от 20% до 40%. Снова установите флажок "TTL".
7. Снова сфокусируйтесь на образце при освещении проходящим светом. Перейдите в программное обеспечение для обработки изображений, выберите лазерную подсветку 491 нм и откройте затвор. Точно отрегулируйте точку фокусировки лазера на потолке и центрируйте ее по центру диафрагмы с закрытым полем при снятом конденсаторе. Поместите конденсор вверх дном на оптическую скамью, чтобы не поцарапать объектив.
8. Замените конденсатор, перейдите в программное обеспечение TIRF и установите глубину проникновения (PD) на 110 нм. Затем переключитесь с широкоугольного освещения на режим освещения TIRF для получения изображения.
9. Найдите клетки, экспрессирующие флуорин, связанные с везикулами, связанные с мембранным белком 2 (VAMP2), через окуляры с помощью широкопольной эпифлуоресценции с эпифлуоресцентным источником света.
   1. Отрегулируйте параметры визуализации (время экспозиции, усиление и мощность лазера) для максимизации отношения сигнал/шум и динамического диапазона, используя минимальное время экспозиции и интенсивность лазера для уменьшения фотообесцвечивания и фототоксичности (например, экспозиция от 50 до 100 мс, с усилением от 15 до 30 при максимальной мощности лазера 30%).
   2. Установите непрерывный автофокус на ячейку. Получение набора таймлапс-изображений с захватом каждые 0,5 секунды в течение 5 минут. Для стимулированного состояния нетрина-1 добавьте 500 нг/мл нетрина-1 в чашку с клетками в ламинарном проточном колпаке и верните чашку в инкубатор на 1 час перед визуализацией.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
35 мм стеклянное дно посуды для визуализации живых клеток	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	Должны быть покрыты поли-D-лизином 1 мг/мл и промыты перед покрытием клеток
Olympus IX81-ZDC2 инвертированный микроскоп	Olympus
Лямбда LS ксеноновая лампа	Sutter Instruments Company
Экологическая сцена топ инкубатор	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF объектив	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Cell TIRF управляющее программное обеспечение	Olympus		Программное обеспечение, используемое для управления лазеры для визуализации TIRF Fiji
(Image J)	NIH	ImageJ version 1.49t
Кролик поликлональный античеловеческий VAMP2	Cell signaling	11829
Poly-D-лизин	Sigma	p-7886	Растворенный в стерильной воде со скоростью 1 мг/мл