Мониторинг экспрессии генов в срезах мозга в режиме реального времени с помощью трехмерной визуализации

Аннотация

Источник: Shimojo, H., et al. Биолюминесцентная визуализация динамики передачи сигналов Notch во время нейрогенеза мышей в режиме реального времени. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео используются культуры кортикальных срезов трансгенных эмбрионов мышей для мониторинга экспрессии генов с помощью трехмерной визуализации. Биолюминесцентные, флуоресцентные и светлопольные изображения используются для визуализации экспрессии генов в реальном времени во время дифференцировки нейронов в нативной ткани.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Визуализация экспрессии люциферазного репортера в культурах среза
   1. Запустите систему визуализации люминесценции в реальном времени перед началом вскрытия. Для культур корковых срезов используют следующие условия: 40%_O2, 5%_CO2 и 37 °C.
   2. Нанесите иммерсионное масло на объектив с 40-кратным увеличением. Поставьте чашку с образцом на предметный столик для микроскопа. Получите флуоресцентное тестовое изображение и установите положение и плоскость фокусировки в интересующую область при освещении возбуждающим светом.
   3. Запустите покадровую съемку с помощью трехмерной (люминесцентная, флуоресцентная и светлая поля) съемки в течение 24 часов (рис. 1F-H). Для получения люминесцентного изображения используйте следующие настройки камеры: низкая скорость передачи (50 кГц), биннинг 2x2/4x4, время экспозиции 10 мин/5 мин. Для получения изображений флуоресценции и яркого поля используйте следующие настройки: промежуточная скорость передачи (1 МГц), биннинг 1x1 и время экспозиции 100 мс.

Результаты

Рисунок 1: Создание корковых срезов эмбрионального конечного мозга и визуализация динамики белка Dll1 в культурах корковых срезов. (А) Проверка экспрессии EGFP с помощью флуоресцентного стереоскопического микроскопа. Красной стрелкой показана...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Циркуляционный охлаждатель воды)	Julabo	Модель: F12-ED
Охлаждаемая ПЗС-камера	Andor Technology	Модель: iKon-M 934
Инкубаторная система	TOKAI HIT	Модель: INU-ONICS
Инвертированный микроскоп	Olympus	Модель: IX81
Инвертированный микроскоп	Olympus	Модель: IX83
Светодиодный осветительный прибор	CoolLED	Модель: pE1
MetaMorph	МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПРИБОРЫ	Модель: 40000
Контроллер смешанного газа	Tokken	Модель: TK-MIGM OLO2
Объектив	Olympus	Модель: UPLFLN 40X O