Визуализация нейронных и сосудистых сетей в курином эмбрионе

Аннотация

Источник: Delalande, J., et.al. Двойная маркировка клеток нервного гребня и кровеносных сосудов в куриных эмбрионах с помощью трансплантации нервной трубки^GFP для цыплят и инъекции красителя карбоцианина DiI. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео демонстрируется трансплантация меченой GFP донорской нервной трубки от трансгенного куриного эмбриона, соответствующего стадии, эмбриону-реципиенту на уровне сомитов от одного до семи, с последующим мечением сосудов с помощью липофильного флуоресцентного красителя. Комбинированный подход позволяет напрямую визуализировать эмбрион под стереофлуоресцентным микроскопом, что позволяет изучать интеграцию нейронного трансплантата и развитие сосудистой сети in ovo.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Пересадка ткани

1. С помощью стеклянной микропипетки осторожно перенесите рассеченную нервную трубку со стекла часов на эмбрион хозяина. Расположите нервную трубку в правильной передне-задней ориентации и осторожно надавите на эксплант, прилегающий к иссеченной области цыпленка-хозяина, с помощью микроскальпеля. Оставьте небольшой фрагмент эктодермы прикрепленным к дорсальной поверхности или вырезав небольшой надрез на ней, чтобы определить ориентацию нервной трубки.
   1. Если необходимо, используйте микроскальпель, чтобы обрезать эксплант до точного размера вырезанной области.
2. Аккуратно проведите нервную трубку в абляционную область и расположите ее так, чтобы дорсальная сторона была правильно ориентирована. Используйте стеклянную микропипетку, прикрепленную к ротовой трубке, для удаления PBS и/или жидкости, окружающей трансплантат. Это помогает тканям донора и хозяина прилипнуть, а трансплантату прижиться.
3. Заклейте все окно прозрачной лентой шириной 24 мм, чтобы предотвратить обезвоживание и загрязнение.
4. Пометьте химерный эмбрион, сделав пометку карандашом на яичной скорлупе и запишите его номер в лабораторную книгу. Верните яйцо в инкубатор для дальнейшего развития.

2. Введите DiI в кровеносные сосуды эмбриона-хозяина

1. В желаемый момент времени эксперимента (здесь, через 3 - 10 дней) извлеките химерный эмбрион из инкубатора и удалите прозрачную ленту с помощью прямых ножниц, чтобы получить доступ к эмбриону внутри яйцеклетки.
2. При необходимости увеличьте окно в скорлупе с помощью ножниц. Будьте осторожны, чтобы не повредить хориоаллантоисную мембрану, если она прикреплена к оболочке, что может привести к кровоизлиянию и поставить под угрозу маркировку кровеносных сосудов.
3. Выберите доступную вену на желтке, следя за тем, чтобы кровоток был направлен к эмбриону. Выберите точку ветвления одной из вителлиновых вен (рис. 1B, C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В E6.5 - E7.5 может потребоваться осторожно отодвинуть хориоаллантоисную мембрану с помощью пинцета, чтобы получить доступ к желточным венам. После Е8.5 единственным вариантом является инъекция в одну из вен хориоаллантоисной мембраны, так как к этому моменту хориоаллантоисная мембрана полностью покрывает эмбрион.
4. Удалите мембрану vitelline выше выбранной точки инъекции с помощью двух пинцетов Dumont #5, разрывая в противоположных направлениях.
5. Разбейте вытянутую стеклянную иглу с помощью Dumont #5 и отрегулируйте ее диаметр до приблизительного размера вены перед загрузкой с помощью CellTracker CM-DiI. Приготовьте стоковый раствор DiI при концентрации 40 мкг/мл в ДМСО и храните при -20 °C. Приготовьте рабочий раствор в 0,3 М сахарозы/PBS в концентрации 4 мкг/л.
   1. Аспирируйте от 5 до 10 мкл DiI в 0,3 М сахарозы/PBS в иглу с помощью отсасывания с помощью ротовой трубки. Для более старых эмбрионов может потребоваться до 25 μл или более. Начиная с E8.5, эмбрионы имеют более крупные, более мышечные вены, которые, возможно, придется удерживать в положении с помощью Dumont #5 перед уколом стеклянной иглой, заряженной DiI.
6. Быстро введите иглу в вену и равномерно подуйте с помощью ротовой трубки, чтобы позволить DiI медленно присоединиться к кровотоку, не образуя сгустка. В качестве альтернативы используйте инжектор давления для подачи DiI.

Результаты

Рисунок 1. Внутривенное введение DiI. (А) Рекомендуемые инструменты: а) капля CellTracker CM-DiI на парапленку, б) игла для инъекций из стекла, в) ротовая трубка. (B) Принципиальная схема внутривенной инъекции DiI в химерный эмб...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Оплодотворенные куриные яйца	Генри Стюарт и Ко, Лаут, Великобритания
Оплодотворенные куриные яйца GFP	Трансгенное куриное хозяйство, Институт Рослина, Эдинбургский
Egg инкубатор (Profi-H Hatcher)	Lyon Technologies, CA, США	910-033
Инкубатор 14C	Прецизионный охлаждаемый инкубатор, Leec Ltd., Ноттингем, Великобритания	Модель LT2
Стереомикроскоп	LEICA	Model MZ 12.5
Цифровая камера	LEICA	DC500
Программное обеспечение для получения изображений	LEICA	IM50
Гусиная шея галогенный источник холодного света	Advanced Imaging Concepts, Inc	KL 1500 LCD
Ротовая трубка	SIGMA - ALDRICH	A5177
Трансферные пипетки, полиэтилен	SIGMA - ALDRICH	Z350796
Dumont #5 щипцы	Fine Science Tools	11251-30
Миниатюрные булавки	Fine Science Tools	26002-15
Щипцы Dumont AA, Нержавеющая эпоксидная смола	Инструменты для науки	11210-10
Sellotape (прозрачный, ширина 24 мм)	Любой поставщик
CellTracker CM-DiI	Молекулярные зонды	C-7001
Капилляры из боросилликатного стекла, тонкостенные без нити	Гарвардский аппарат	PY8 30-0035

университет