$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Дифференциально-интерференционно-контрастная (DIC) Покадровая микроскопия ветвления аксона
Примечание: Хотя в этом протоколе используется DIC, для тех же целей могут использоваться и другие методы микроскопии в проходящем свете (например, фазовый контраст).
- Через 2 дня in vitro (DIV) поместите стеклянную донную чашку для визуализации, содержащую нетрансфицированные нейроны, в предварительно нагретую камеру окружающей среды для поддержания влажной среды с 5% CO2 и 37 °C. Используйте микроскоп, оснащенный 60-кратным план-апохроматом, объективом DIC с числовой апертурой 1,4 и конденсатором с высоким NA для достижения наилучшего качества изображения и разрешения.
- Отрегулируйте фокальную плоскость, чтобы найти нейроны через окуляры с помощью проходящего светового освещения.
- Используя функцию сбора данных по нескольким областям в программном обеспечении для обработки изображений, найдите и сохраните местоположения XYZ, по крайней мере, 6 ячеек. Расположите сцену так, чтобы интересующие вас нейроны помещались в поле зрения для достижения наилучших результатов.
- Стимулируйте с помощью 250 нг/мл нетрина-1 и нажмите 'начать многозонное получение'. Последовательно получайте изображения в каждом положении каждые 20 секунд в течение 24 часов, приостанавливая съемку и перефокусируясь по мере необходимости.
- Просматривайте изображения в программном обеспечении для обработки изображений с помощью Apps>Review Multidimensional Data>open file name. Определите стабильные ветви аксонов (длиной 20 мкм), которые формируются во время сеанса визуализации. Используйте инструмент рисования линий для измерения устойчивой ветви аксона от основания аксона до кончика, чтобы убедиться, что достигнута квалификация длины 20 мкм.
- В электронной таблице запишите номер кадра после стимуляции нетрина, когда выступы мембраны начинаются в областях, где позже образуются ветви, а также номер кадра после стимуляции нетрина, когда зарождающиеся ветви достигают 20 мкм в длину.
- Умножьте количество кадров между выступом и формированием ветви на 20 секунд, чтобы рассчитать время формирования одной ветви.