Двухфотонная визуализация динамики микроглии в гиппокампе мыши in vivo

Аннотация

Источник: Kamei, R., et al., In vivo хроническая двухфотонная визуализация микроглии в гиппокампе мыши. J. Vis. Exp. (2022)

В видеоролике демонстрируется процесс настройки и визуализации in vivo двухфотонной микроскопии динамики микроглии в гиппокампе CA1 (Cornu ammonis 1) и зубчатой извилине, что обеспечивает оптимальное оптическое выравнивание и оценку структурной целостности.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Хроническая двухфотонная визуализация микроглии in vivo с использованием мышей CX3CR1-GFP

1. После введения анестезии промойте внутреннюю часть металлической трубки стерильным физиологическим раствором для удаления мусора. Убедитесь, что белая альвеус гиппокампа видна через стекло (рисунок 1A) и что нет осложнений, таких как послеоперационное кровотечение.
2. Поместите мышь под двухфотонный микроскоп в следующих шагах:
   1. Установите мышь в устройство для удержания головы под объективом двухфотонного микроскопа и на моторизованный сканирующий столик XY. Используйте грелку для термоподдержки. Контролируйте и регулируйте глубину анестезии, так как проверка качества может занять до 30 минут. заметка: Рекомендуется использовать объектив с погружением в воду с рабочим расстоянием (WD) более 3 мм и высокой числовой апертурой (NA). Корректирующее кольцо линзы объектива может улучшить разрешение, компенсируя несоответствие показателя преломления между стеклом и биоматериалами.
   2. Заполните пространство между стеклом и линзой объектива водой, уделяя особое внимание тому, чтобы не было пузырьков воздуха. При необходимости увеличьте площадь металлической пластины с помощью полиэтиленовой пленки, которая удерживает больше воды, чтобы покрыть всю переднюю линзу объектива.
   3. Включите фемтосекундный импульсный лазер с длиной волны 920 нм для возбуждения флуоресцентных зондов, экспрессируемых в мозге, и запустите программное обеспечение для получения изображений.
   4. Настройте фокусировку на CA1 (Cornu Ammonis 1) с помощью моторизованного столика и моторизованной системы фокусировки. Расположите целевую структуру под руководством флуоресценции, излучаемой паренхимой мозга, и отраженного света от края металлической трубки под непрерывным освещением импульсным лазером.
   5. Измерьте глубину паренхимы мозга до касания стеклянного дна, регулируя фокусировку с помощью моторизованной системы фокусировки. Сравните глубины в разных горизонтальных местах, чтобы оценить выравнивание стеклянного дна и плоскости изображения.
      1. Отрегулируйте угол наклона головки мыши, наклонив устройство удержания головы до тех пор, пока дно стекла не станет параллельным плоскости изображения.
   6. Отрегулируйте корректирующее кольцо объектива для достижения наивысшего разрешения на глубине целевой структуры в CA1.
3. Проверьте качество и интенсивность изображений, полученных при двухфотонном возбуждении гиппокампа (рис. 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ухудшение изображения указывает на наличие повреждения тканей внутри мозга.
4. Убедитесь, что микроглия уже восстановила свою разветвленную морфологию (Рисунок 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данные визуализации микроглии указывают на то, что требуется не менее 3-4 недель, чтобы микроглия вернулась в свое базальное состояние.
5. Выполните визуализацию in vivo в любых слоях CA1 для конкретной цели эксперимента.

Результаты

Рисунок 1: Визуализация микроглии in vivo у мышей CX3CR1-GFP в хронической фазе. (A) Репрезентативный внешний вид имплантированного окна на правой спинной части CA1 (Cornu Ammonis 1) в ...

Материалы