Интраназальная доставка мезенхимальных стволовых клеток у мышей с черепно-мозговой травмой

Аннотация

Источник: Shahror, R. A. et al., Отслеживание мезенхимальных стволовых клеток, меченных оксидом железа, с помощью МРТ после интраназальной доставки в мышиной модели черепно-мозговой травмы. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется интраназальная доставка мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в мышиной модели. МСК абсорбируются в носовую ткань, мигрируют в мозг через цитокиновые сигналы и секретируют нейротрофические факторы в месте повреждения, предлагая нейротерапевтический потенциал для восстановления нейронов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Мечение мезенхимальных стволовых клеток (МСК) суперпарамагнитными наночастицами оксида железа (SPIO)

1. Чтобы мечить МСК SPIO, добавьте 6 мл среды для мечения (25 мкг/мл SPIO в модифицированной среде Dulbecco Eagle Medium (DMEM) без фетальной бычьей сыворотки (FBS)) в колбу T75, содержащую МСК (80% конфлюенции).
2. Инкубируйте клетки с маркирующей средой в инкубаторе с_СО2 (37 °C, 5%_СО2) без встряхивания. Через 24 ч аккуратно удалите этикетировочный носитель с помощью стерильной пастеровской пипетки с пластиковым наконечником, прикрепленной к вакууму. Промойте монослой клеток 2 раза 6 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), чтобы удалить любые следы неинтернализованного SPIO.
   1. Чтобы определить, были ли клетки успешно помечены, проверьте помеченные клетки под флуоресцентным микроскопом или конфокальным микроскопом, если SPIO помечен флуорофором (т.е., как те, которые используются здесь; Рисунок 1B, C).
3. Соберите адгезивные клетки путем обработки 3 мл трипсина и инкубируйте при 37 °C. Через 5 минут инкубации добавьте 7 мл предварительно подогретой среды DMEM с 10% FBS (v/v) для инактивации трипсина. Соберите клеточную суспензию с помощью пипетки в коническую пробирку объемом 15 мл.
4. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в PBS. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью трипанового синего красителя и гемоцитометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная гранула меченых клеток будет иметь темный цвет из-за содержания железа (Рисунок 1D). Этот протокол актуален для мечения МСК и магнитно-резонансной томографии (МРТ). Процедура мечения МСК была ранее оптимизирована, и здесь включены только шаги по подготовке меченых МСК к отслеживанию in vivo, поскольку основное внимание уделяется отслеживанию in vivo. Протокол культивирования и мечения других типов клеток должен быть оптимизирован исследователем.
5. Отрегулируйте концентрацию клеток с помощью PBS до 150 000 клеток (или числа, которое приводит к достаточному сигналу МРТ) в 18 мкл PBS (или общего объема, который будет использоваться при интраназальной доставке).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Было замечено, что концентрация клеток выше 150 000 клеток/18 мкл PBS приводит к агрегации клеток, что может повлиять на эффективность интраназального рода. Если для интраназальной доставки требуется большее количество клеток, увеличьте общий объем клеточной суспензии и увеличьте количество интраназальных введений, поскольку интраназальное введение является неинвазивной процедурой, и возможно многократное дозирование.

2. Травма с контролируемым кортикальным воздействием (ЧМТ

)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе самцы мышей C57 BL/6 (в возрасте 7–8 недель) содержались в 12-12-часовом цикле свет/темнота с ограниченным доступом к пище и воде.

1. Чтобы подготовить каждую мышь к травме ЧМТ, введите обезболивающий коктейль золазепама (50 мг/кг) и ксилазина (20 мг/кг) путем внутрибрюшинной инъекции (1 мл/кг). Убедитесь, что глубина анестезии достаточна за счет отсутствия реакции на щипцы ног. В качестве альтернативы поместите мышь в камеру с 2%–4% изофлураном на 60 с.
2. Сбрейте шерсть спинной поверхности черепа между ушами с помощью электронной машинки для стрижки волос. Очистите выбритый участок несколько раз с помощью стерильного ватного тампона, смоченного в йоде. Используйте ватный тампон, смоченный в 70% этаноле, чтобы смыть йод.
3. Поместите мышь под наркозом в стереотаксическую рамку и закрепите мышь с помощью ушных и носовых планок. Сделайте среднесагиттальный разрез (примерно 2,5 см) на выбритой коже с помощью стерильных ножниц для доступа к поверхности черепа.
4. Удалите ткань на кости с помощью ватного диска, чтобы обнажить череп. Очистите поверхность черепа ватным тампоном, смоченным в 3% перекиси водорода (H₂O₂) в течение 10 секунд, затем очистите ее сухим ватным диском.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Швы черепа, а также брегма и лямбда теперь могут быть легко идентифицированы.
5. Определите координаты на поверхности черепа для травмы ЧМТ и нарисуйте круг (диаметром 4 мм) вокруг этих координат с помощью карандаша или соответствующего маркера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе для индукции ЧМТ использовались координаты в переднезаднем положении (AP) -2,0 мм и медиолатеральном (ML) +1,5 мм.
6. С помощью микродрели и круглого заусенца (диаметром 0,5 мм) утончите череп на отмеченном круге. Избегайте давления во время сверления, так как сверление кости может привести к повреждению паренхимы мозга. Удалите костную пыль с помощью чистой и сухой ватной палочки.
7. Аккуратно удалите костный лоскут с помощью стерильных тонких щипцов, чтобы обнажить твердую мозговую оболочку, сохраняя ее неповрежденной. Извлеките мышь из стереотаксической рамки, которая использовалась для подготовки к травме, и поместите ее в стереотаксическую рамку устройства CCI.
8. Стабилизируйте голову мыши с помощью ушных и носовых планок. Убедитесь, что головка мыши находится на одном уровне в рострально-каудальном направлении, и при необходимости отрегулируйте носовые полосы.
9. Следуйте инструкциям на блоке управления, чтобы пристрелить наконечник импактора к открытой поверхности коры головного мозга. Убедитесь, что кончик ударного элемента выровнен непосредственно над желаемыми координатами коры головного мозга, на которые необходимо нанести удар, с помощью колес управления X и Y на основании ударного элемента.
10. Параметры эксперимента задают с помощью блока управления со скоростью 5 м/с, временем выдержки 250 мс и глубиной травмы 1 мм, чтобы вызвать легкую травму мыши.
11. Нанесите травму, нажав кнопку «удар» на блоке управления. Смойте любое возникающее кровотечение с помощью стерильного ватного тампона.
12. Извлеките мышь из стереотаксической рамки и закройте разрез с помощью шелковых хирургических швов. Не используйте металлические зажимы для закрытия места операции, так как для проведения МРТ мышь будет подвергаться воздействию магнитного поля.
13. Нанесите местные антибиотики (бацитрацин неомицин) на операционное поле для предотвращения инфекций. Держите мышь на грелке и внимательно следите за ней во время фазы восстановления.
14. Применяют кетопрофен (2,5 мг/кг, ВП) ежедневно в течение 3 дней после операции, если применение кетопрофена не противоречит целям исследования.

3. Интраназальное введение

1. Через 1 день после индукции ЧМТ введите обезболивающий коктейль золазепам (50 мг/кг) и ксилазин (20 мг/кг) путем внутримышечного введения. Убедитесь, что мышь глубоко обезболена из-за отсутствия реакции на щипцы ног.
2. Подготовьте мышь к интраназальному введению МСК с помощью лечения гиалуронидазой.
   1. Возьмитесь за загривок мыши и сильно перевернитесь на спину, обездвиживая череп. Поместите кончик пипетки, содержащей гиалуронидазу в стерильном PBS (4 Ед/μл), рядом с ноздрей мыши под углом 45°.
   2. Введите 3 мкл суспензии гиалуронидазы в каждую ноздрю. Держите мышь обездвиженной и обращенной вверх стороной вверх на чистом коврике в течение 5 минут. Повторите лечение гиалуронидазой 4 раза (всего 100 Ед суспензии гиалуронидазы).
3. После лечения гиалуронидазой держите обработанную мышь на чистом подушечке лицевой стороной вверх в течение 30 минут.
4. Чтобы доставить МСК в мозг, крепко держите мышь, как описано в шаге 3.2.1. Введите 3 μл/ноздрю суспензии МСК с интервалом 3 с. Продолжайте удерживать мышь в одном и том же положении в течение 30 секунд, пока капли образца полностью не исчезнут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха во время введения.
5. Повторите введение с 2-минутным интервалом до 3 мкл<бр/>ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество клеток, подлежащих доставке, составляет 150 000, так что 18 мкл клеточной суспензии может быть доставлено в дозировке 3 мкл на каждую ноздрю, в 3 раза на каждую.
6. Верните мышь в клетку и внимательно следите за ней, пока она полностью не оправится от анестезии.

Результаты

Рисунок 1: Схематическая блок-схема протокола и in vitro подтверждение использования SPIO MSC. (A) МСК инкубировали с SPIO в течение 24 часов для мечения. Затем меченые МСК были доставлены в мышиную модель с ЧМТ интраназальным (IN) путем. Для отслеживания...

Материалы