Визуализация быстрых кальциевых транзиентов в нервных окончаниях мышей с помощью конфокальной микроскопии

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах levator auris longus (m. LAL) от мышей BALB/C (20-23 г, возрастом 2-3 месяца).

1. Приготовление растворов Рингера и Филлинга

1. Приготовьте раствор Рингера для мышц млекопитающих, смешав следующие ингредиенты: хлорид натрия, NaCl (137 мМ), хлорид калия, KCl (5 мМ), хлорид кальция, CaCl₂ (2 мМ), MgCl₂ (1 мМ),₂PO₄ (1 мМ), NaHCO₃ (11,9 мМ) и глюкозу (11 мМ). Проведите через раствор с 95% кислорода (O₂) и 5% углекислого газа (CO₂) и отрегулируйте его pH до 7,2-7,4, добавив при необходимости соляную кислоту / гидроксид натрия (HCl / NaOH).
2. Приготовьте раствор для загрузки красителя.
   1. Приготовьте (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтансульфоновую кислоту (HEPES) (10 мМ) с pH в диапазоне 7,2-7,4. 500 мкг коммерческого красителя входит во флакон объемом 500 мкл. Растворите краситель в 14 μл раствора HEPES до получения концентрации красителя 30 мМ. Хорошенько встряхните и центрифугируйте до полного растворения.
   2. Раствор индикатора Ca²⁺ разбавить раствором HEPES до концентрации до 1 мМ. Храните его в морозильной камере (-20 °C) и избегайте воздействия света.

2. Процедура загрузки красителя

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура загрузки красителя выполняется в соответствии с протоколом загрузки через культю нерва, адаптированным из ранее опубликованных протоколов.

1. Рассекайте мышцу LAL в соответствии с процедурой рассечения данного препарата, описанной в ранее опубликованных протоколах.
   1. Зафиксируйте слегка растянутую ткань (не более 30% от первоначальной длины) в покрытой эластомером чашке Петри тонкими булавками из нержавеющей стали и добавляйте раствор Рингера до полного покрытия мышцы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чашка Петри была предварительно заполнена эластомером в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
2. Подготовьте пипетку для наполнения
   1. Используя съемник микропипетки (см. Таблицу материалов), подготовьте микропипетку с тонким кончиком, который является как можно более острым для внутриклеточных записей. Используйте капилляры без внутренних нитей (1,5 мм по внешнему диаметру и 0,86 или 1,10 мм по внутреннему диаметру).
   2. Отломите наконечник микропипетки после надрезания конуса абразивом, оставив наконечник открытым примерно до 100 мкм в диаметре. Отполируйте наконечник до предела, когда внутренний диаметр уменьшится с >80 мкм до 12-13 мкм. Прикрепите силиконовую трубку к одной стороне пипетки для наполнения, а шприц (без иглы) — к другой.
3. Под стереомикроскопом найдите место, где нервный ствол превращается в отдельные нервные ветви. Поместите пипетку для наполнения с установленной трубкой и шприц на чашку Петри с помощью воска. Перемещайте кончик пипетки так, чтобы он оказался над нервом.
4. Тонкими ножницами разрежьте нерв близко к мышечному волокну, оставив небольшой кусочек культи нерва длиной около 1 мм. Аккуратно втяните культю нерва вместе с небольшим количеством раствора Рингера, не зажимая его, в кончик пипетки для наполнения. Извлеките силиконовую трубку из пипетки для наполнения.
5. Наберите некоторое количество раствора, загружающего краситель (~0,3 мкл) с помощью шприца с длинной нитью. Этот объем соответствует примерно 3 см нити накала.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначально необходимо изготовить нить накала из наконечника пипетки объемом 10 мкл, потянув на огонь с помощью спиртовой лампы или газовой горелки.
6. Аккуратно вставьте наконечник нити с раствором для загрузки в заправочную пипетку. Выпустите смесь непосредственно на культю нерва. Инкубировать препарат при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.
7. После этого препарат промыть свежим раствором Рингера и выдерживать при температуре 25 °С до 2 ч в стеклянном стакане с 50 мл (или более) раствором Рингера (препарат должен быть покрыт раствором). За это время краситель достигнет синапсов.

3. Видеосъемка с помощью конфокальной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Регистрация кальциевых транзиентов осуществляется с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа (ЛСКМ) (см. Таблицу материалов). Для регистрации быстрых кальциевых переходных процессов использовался оригинальный протокол, позволяющий регистрировать сигналы с достаточным пространственным и временным разрешением. Микроскоп был оснащен 20-кратным объективом для погружения в воду (числовая апертура 1,00 (NA)). Лазерная линия с длиной волны 488 нм была ослаблена до 10% интенсивности, а эмиссионная флуоресценция была собрана в диапазоне от 503 до 558 нм.

1. Поместите препарат в экспериментальную камеру, покрытую силиконовым эластомером, и зафиксируйте ее, слегка растянутую, набором стальных микроигл. Тщательно промойте препарат раствором Рингера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использовалась простая, изготовленная на заказ экспериментальная перфузионная камера, изготовленная из органического стекла с дном камеры, покрытой эластомером (приготовленным в соответствии с инструкциями производителя; см. Таблицу материалов). В камере предусмотрена трубка подачи раствора. Раствор откачивается с помощью иглы шприца, установленной на магнитном держателе (см. Таблицу материалов). В качестве экспериментальной камеры можно использовать чашку Петри (подобную той, которая используется для инкубации препарата), но с присоединенными подающими и всасывающими трубками.
2. Установите всасывающий электрод, который будет использоваться для стимуляции нерва.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите и зафиксируйте электрод, нанеся на него восковую эпиляцию, рядом с ванной. Переместите кончик близко к культе нерва и втяните его в электрод.
3. Установите подготовительную камеру на предметный столик микроскопа и поместите входные и выходные фитинги внутрь камеры.
4. Для перфузии препарата используйте простую систему с гравитационным потоком. Включите перфузионный аспиратор, чтобы удалить излишки раствора.
5. Подключите стимулирующий всасывающий электрод к электростимулятору и убедитесь, что после стимуляции происходят мышечные сокращения. Условия стимуляции и запись см. в разделах 3.9-3.12.
6. Заполните перфузионную систему раствором Рингера с d-тубокурарином (10 мкМ).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор помогает предотвратить мышечные сокращения. D-тубокурариновые или альфа-бунгаротоксин-специфические блокаторы никотиновых ацетилхолиновых рецепторов на постсинаптической мембране полностью или частично блокируют мышечные сокращения. Кроме того, для предотвращения мышечных сокращений можно использовать специфические блокаторы постсинаптических натриевых каналов, такие как μ-конотоксин GIIIB.
7. Включите перфузионный аспиратор и начните перфузию препарата с раствором Рингера, содержащим d-тубокурарин.
8. Задайте параметры визуализации в программном обеспечении LSCM следующим образом.
   1. В программном обеспечении LCM (LAS AF; СМ. Таблицу материалов) выберите Electrophysiology.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом режиме, когда изображение захватывается в определенный момент времени, синхронизирующий импульс отправляется на стимулятор с помощью триггерного блока. Это вызывает генерацию потенциала действия в препарате (рис. 1; блок стимулятора).
   2. Выберите Режим сбора данных. Для запуска стимулятора с помощью синхроимпульса микроскопа в настройках меню Задание выберите Настройки триггера. Установите в поле Trigger Out On Frame значение канала out1.
   3. Используйте следующие настройки: Режим сканирования: XYT, Частота сканирования: 1400 Гц, Коэффициент масштабирования: 6,1, Отверстие: полностью открыто. Убедитесь, что режим Bidirectional X для последовательного пропускания включен.
   4. Установите минимальное время формирования кадра равным 52 мс и кадры для сбора в необработанное видео — 20 кадрами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки позволяют захватывать изображения с разрешением 128 x 128 пикселей при съемке одного кадра каждые 52 мс.
   5. Установите длину волны возбуждения аргонового лазера на 488 нм с 8% выходной мощности.

Нажмите кнопку Live Mode, чтобы переключиться в режим Live, который помогает получить предварительный просмотр нервных окончаний, загруженных красителем.

9. Единица стимуляции
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это устройство позволяет устанавливать временные параметры стимуляции с помощью программного обеспечения MATLAB.
   1. Создайте новый файл, вставьте код из вышеупомянутой статьи в окно кода MatLab и сохраните файл. Нажмите на кнопку «Запустить», после чего появится окно с параметрами стимуляции. Установите время задержки и продолжительность стимула.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Задержка определяет временное разрешение восстановленного флуоресцентного сигнала. Электрический импульс длительностью 0,2 мс задерживается, а затем направляется в изолятор. Последний формирует амплитуду и полярность стимулирующего импульса и электрически изолирует биологический объект от регистрирующей аппаратуры.
   2. Для стимуляции нерва необходимо выбрать сверхмаксимальную амплитуду стимулирующего импульса (на 25%-50% превышающую максимальную интенсивность стимуляции, необходимую для активации всех нервных волокон).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный метод основан на специальном алгоритме регистрации одиночных быстрых флуоресцентных сигналов с помощью LSCM с минимальной разверткой. На каждом шаге разработанного алгоритма регистрируемый флуоресцентный сигнал смещается от предыдущего на временной интервал, который короче развертки микроскопа. Величина временных сдвигов определяет временное разрешение требуемого сигнала. Количество шагов (сдвигов) в алгоритме зависит от требуемого временного разрешения и исходного временного разрешения. При таком способе регистрации стимуляция препарата проводится с частотой 0,25 Гц.
10. В режиме Live ищите ROI и получайте наилучший фокус. Запустите программное обеспечение для сбора данных.
11. Сдвиньте задержку на стимуляторе на 2 мс меньше относительно предыдущего значения и запустите программу сбора данных.
12. Повторите шаг 3.11 26 раз, чтобы получить 26 последовательностей, при этом каждая последовательность будет смещена на 2 мс от предыдущей.

Рисунок 1: Схема экспериментальной установки. 1. Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (ЛСКМ). 2. Модуль синхронизации LSCM (триггерная коробка). 3. Стимулятор. 4. Изолятор. 5. Биологический образец. 6. Всасывающий электрод для электростимуляции нерва. 7. Перфузионные системы (7а: резервуар для перфузата, 7б: капельница, 7с: регулятор потока, 7д: вакуумная колба). Стрелки указывают на направление распространения синхронизирующего импульса.