Транскраниальная электростимуляция моторной коры головного мозга у бодрствующей крысы

Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарной экспертной комиссией JoVE.

1. Хирургическая процедура: Имплантация электрода в грудную клетку

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап можно пропустить, если противоэлектрод размещен снаружи на выбритой груди с помощью жилета.

1. Положите грызуна лежа (на грудную клетку) на операционный стол.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае ингаляционной анестезии держите рыло крысы в месте насадки для анестезии, еще больше снизив концентрацию изофлурана до 1,5-2%.
2. Продезинфицируйте выбритую кожу головы дезинфицирующим спреем или тампоном, смоченным в антисептическом средстве (например, этанол 70%), и дайте высохнуть на воздухе. Повторите два раза.
3. Разрежьте кожу скальпелем по одной линии от рострального уровня глаза до уровня среднего уха.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет проложить туннель соединительного кабеля от имплантированного грудного электрода к верхней части головы, а также является желаемым разрезом для установки гнезда электрода для стимуляции постоянным током (DCS).
4. Переверните крысу в положение лежа на спине, чтобы грудь была обнажена.
5. Продезинфицируйте кожу грудной клетки, как описано в пункте 1.2.
6. Тканевые щипцы приподнимают боковую кожу правой грудной клетки и маленькими ножницами размером около 0,5 см медиально от правой подмышечной впадины вырезают петлицу. Затем сделайте ножницами прямой сагиттальный разрез в краниальной ориентации.
7. Сформировать подкожный мешочек путем атравматичного отсоединения кожи от левой главной грудной мышцы. Для этого несколько раз разомкнув маленькие ножницы (или ватную палочку, смоченную в физрастворе).
8. Поверните животное на правый бок, чтобы проложить туннель кабельной дорожки от левого затылочного угла вскрытой кожи головы вдоль шеи к выходу в грудной мешок, проникая в поверхностную фасцию с помощью гомеостатических щипцов.
9. Осторожно откройте гомеостатические щипцы, чтобы ухватиться за конец электродного кабеля, прикрепленного к платиновому электроду, не позволяя острым проводам сбиться. Протяните кабель через туннель до тех пор, пока электрод не войдет в мешочек, ориентированный точкой пайки на левую заднюю конечность грызуна. Поверните грызуна обратно в положение лежа.
10. Закрепите платиновую пластину стерильным синтетическим плетеным, нерассасывающимся швом к грудной фасции в двух противоположных угловых отверстиях (рекомендуется 4-5 узлов для устойчивости).
11. Аналогично прикрепите кабель к фасции за свободный узел, образовав небольшую петлю перед входом в тканевый тоннель.
12. Закройте кожу 3-4 кожными швами, в зависимости от размера разреза (для электрода и кабеля можно использовать один и тот же материал швов).

2. Хирургическая процедура: Установка эпикраниальной транскраниальной электрической стимуляции мозга (tES)

1. Поместите животное в стереотаксическую рамку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании ингаляционной анестезии снизьте концентрацию анестетика до поддерживающего потока изофлурана ~1,5-1%, отрегулированного в соответствии с рефлексом защемления пальцев ног и характером дыхания.
2. Продезинфицируйте выбритую кожу головы, как описано в шаге 1.2.
3. Разрежьте кожу скальпелем по одной линии от рострального уровня глаза до уровня среднего уха.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если проводилась установка грудного электрода, шаги 2.2 и 2.3 уже выполнены.
4. Соскребите скальпелем надкостницу (соединительную ткань на черепе) в стороны и тщательно протрите ватными палочками. Зафиксируйте соединительную ткань в 4 углах разреза бульдожьими зажимами и дайте им свисать сбоку, чтобы операционное поле оставалось открытым.
5. Нанесите 0,9% физиологический раствор для очистки костной поверхности и тканей ватными палочками. Затем очистите поверхность кости с помощью 3% H₂O₂. Следует избегать контакта с тканью. Таким образом, кость очищается более тщательно, и незначительные кровотечения из кости останавливаются. Также становятся заметны остатки надкостницы. Удалите эти остатки ватным тампоном с умеренным давлением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление остатков надкостницы увеличит адгезию и долговечность гнезда tES, приклеенного к кости.
   1. В случае неостановимого кровотечения используйте костяное сверло и коснитесь его в течение 1-3 секунд, слегка надавливая на кость. Эта механическая процедура в большинстве случаев останавливает кровотечение без значительного нагрева. Никогда не используйте электрокоагуляцию на кости; Даже кратковременное применение приведет к повреждению тканей мозга (электрокагуляцию следует использовать только при кровотечении из раневой ткани).
6. Поскольку крепежные винты улучшают сцепление с установкой, выбирайте сверло, соответствующее размеру шурупа. Поместите два отверстия для заусенцев на две разные костные пластины, предварительно просверлив ручным сверлом, а затем слегка надавите на него с помощью костного сверла. Избегайте непосредственной близости к желаемому положению гнезда tES, так как это может затруднить ввинчивание электрода (например, для левого первичного моторного кортикального tES выбирайте правое фронтальное и заднее теменное положение винтов).
7. В случае имплантированного противоэлектрода проделайте заусенец в третьем отверстии, расположенном в правой задней теменной кости, для будущей фиксации туннельного кабеля.
8. Вставьте пластиковые винты в отверстия для заусенцев и закручивайте до тех пор, пока не почувствуется первое трение. Затем выполните три дополнительных оборота винта на 180°. Проверьте щипцами стабильность винта и добавьте еще один оборот, если он недостаточно тугой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для взрослых крыс это обеспечит эпидуральную установку винтов без повреждения твердой мозговой оболочки или мозга (в зависимости от конструкции резьбы винта число оборотов может варьироваться). Использование винтов из нержавеющей стали также должно быть целесообразным, так как даже при плотностях тока DCS выше порога нейродегенерации; Установка винтов не изменяла расположение поражения или степень ниже винтов.
9. Включите паяльник и разогрейте его примерно в течение 5 мин. Намотайте кабель, выходящий из тканевого туннеля, окципитально вокруг правого теменного винта, а затем разрежьте его, оставив кабель длиной около 1 см позади обмотки. Аккуратно зачистите изоляцию на конце кабеля скальпелем.
10. Закрепите намотанный кабель на винте и кости с помощью цианоакрилового клея.
11. Нанесите небольшое количество бессвинцового оловянного припоя на разъем и на оголенные провода контрэлектродного кабеля и соедините их, кратковременно прижав обе предварительно припаянные части друг к другу, касаясь жала паяльника, пока оловянный припой не расплавится (около 2-3 с). Немедленно снимите жало паяльника, чтобы избежать чрезмерного нагрева металла кабеля с последующим повреждением тканей.
12. Возьмите изготовленную на заказ гильзу для электродов tES (рис. 1B, красным цветом) с щипцами с изогнутым зубчатым концом и нанесите тонкий слой цианоакрилового клея на нижний край гильзы. Для размещения над моторной корой головного мозга и с помощью лунки диаметром 4 мм поместите среднюю точку впадины на расстоянии 2 мм спереди и 2 мм латерально от брегмы. Для этого положения внутренняя медиальная граница впадины должна заканчиваться непосредственно на сагиттальном шве, а каудальная граница должна заканчиваться на высоте брегмы. Кратковременно прижмите гнездо к кости (большинство цианоакриловых клеев затвердевают под давлением).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение источника света непосредственно над гнездом может облегчить его размещение.
13. Убедитесь, что кость в области лунки свободна от клея (проверив с помощью света, потому что клей является отражающим). В случае разлива клея удалите гнездо, соскребите клей скальпелем и повторите шаг 2.12.
14. После того, как лунка будет на месте и будущая область стимуляции освободится от клея, сначала запечатайте боковую границу лунки с соседней тканью небольшой каплей цианоакрилового клея, чтобы избежать образования жидкостного мостика, который может привести к шунтированию тока в этом месте. Не наносите слишком много клея, так как он может попасть в зону стимуляции (в этом случае вернитесь к шагу 2.12).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно не допускать попадания клея в область стимуляции, так как уменьшение площади стимуляции может привести к резкому увеличению плотности тока (А/м²).
15. Покройте все винты цианоакриловым клеем.
16. Смешайте двухкомпонентный стоматологический акриловый цемент в небольшой силиконовой трубке или стакане. Как только она станет вязкой, наложите ее стоматологическим шпателем, чтобы прикрепить оставшиеся границы лунки к кости. Избегайте попадания стоматологического акрилового цемента в зону стимуляции.
17. Наконец, покройте весь череп, винты, кабель счетчика электрода и гнездо до 1/3 лунки стоматологическим акриловым цементом. Следите за тем, чтобы цемент имел правильную вязкость: если он будет слишком жидким, то будет стекать в окружающие ткани; Если он слишком твердый, его трудно распределить равномерно.
18. Когда вся кость будет покрыта и цемент затвердеет, снимите бульдожьи зажимы; кожа должна только касаться скопившегося цемента, чтобы не нужно было накладывать швы. (Если первоначальный разрез был выбран слишком длинным и соединительная ткань или мышца видна, наложите шов, как описано в шаге 1.12).
19. Нанесите один слой йода ватным тампоном вокруг края разрезанной кожи и подкожно введите карпрофен (5 мг/кг массы тела, растворенный в 5-7,5 мл 0,9% физиологического раствора для лечения боли и восполнения жидкости).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы используете ингаляционную анестезию, отключите ее сейчас.
20. Поместите грызуна в согревающую камеру для восстановления после анестезии до тех пор, пока грызун не придет в себя и не восстановится постуральная стабильность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневно проверяйте рост веса животного, состояние ран и общие критерии благополучия в соответствии с рекомендациями учреждения.

3. Процедура транскраниальной электростимуляции

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку анестезия влияет на эффекты tES, рекомендуется проводить стимуляцию у бдительных грызунов, когда это возможно. Дайте грызуну восстановиться не менее 5 дней (заживление раны головы и груди) перед началом экспериментов. Эксперименты можно проводить в более ранние моменты времени после операции при использовании внешнего противоэлектрода, закрепленного жилетом, так как рана в груди наиболее раздражительна, но животных необходимо приучать к электродовому жилете в течение нескольких дней, и может возникнуть вмешательство в поведенческие задачи.

1. Заполните гнездо электрода tES наполовину 0,9% физиологическим раствором и удалите пузырьки воздуха.
2. Перед сеансами катодной транскраниальной стимуляции постоянным током (tDCS) всегда проверяйте хлорирование и при необходимости (например, блестящая серебристая поверхность) повторно хлорируйте электрод Ag/AgCl. Перед сеансами анодного tDCS удалите возможные избыточные отложения AgCl от предыдущих стимуляций с помощью наждачной бумаги, чтобы обеспечить хорошую проводимость во время стимуляции. Вкрутите завинчивающуюся крышку электрода tES (Рисунок 1B, серая часть).
   ВНИМАНИЕ: Отсутствие повторного хлорирования электрода между сеансами катодного tDCS приведет к истощению хлорирования во время стимуляции и накоплению токса в результате электрохимической реакции. Это приведет к повреждению тканей. Повторное хлорирование не требуется в течение одного сеанса, если продолжительность стимуляции меньше 20 минут.
3. Подключите кабели к двум разъемам на голове (для анодной стимуляции анодный кабель подключается к разъему на винтовой крышке, для катодной стимуляции - наоборот).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании наружного противоэлектрода накройте противоэлектрод проводящим гелем и положите его на грудь грызуна. Сделать это проще всего, если электрод предварительно закреплен в небольшом жилете для грызуна, который грызун может носить во время стимуляции.
4. Поместите грызуна в экспериментальную клетку, при этом кабели будут подключены к вертлюгу над клеткой, который обеспечивает свободное движение.
5. Включите стимулятор и отрегулируйте параметры стимуляции (интенсивность стимуляции, продолжительность, время нарастания и нарастания).
6. Если вы не используете имеющееся в продаже устройство для стимуляции с аварийной сигнализацией отключения и отключения, включите в цепь счетчик для проверки постоянного потока тока.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При такой настройке стимуляция может применяться во время выполнения или тренировки поведенческих задач.
7. Проверьте наличие признаков стресса или дискомфорта у грызуна во время стимуляции.
8. После окончания стимуляции отсоедините кабели, открутите колпачок электрода на голове, а также очистите и высушите гнездо ватным тампоном. Верните грызуна в домашнюю обстановку или при желании проведите поведенческую процедуру.

Рисунок 1: Расходные материалы для хирургии и техническая схема гнезда tES и блока электродного колпачка. (А) 1. Ватные палочки, 2. дезинфицирующее средство, 3. стереотаксическая рамка, 4. паяльник, 5. обезболивающее (например, карпрофен), 6. и 7. анестетики (например, ксилазин и кетамин), 8. шприц, 9. клиппер, 10. Дырокол для ушей, 11. глазная мазь (например, бепантен), 12. бессвинцовый оловянный припой, 13. двухкомпонентный стоматологический акриловый цемент (ЦАП), 14. йод, 15. 3% H2O2, 16. 0,9% физиологического раствора, 17. синтетический плетеный нерассасывающийся шовный материал (например, мерсилен 4-0), 18. сверла, 19. Клей цианоакриловый, 20. Бульдожьи хомуты 21. гомеостатические щипцы, 22. Щипцы с изогнутым, зазубренным наконечником, 23. щипцы с острым кончиком, 24. прямые, тканевые щипцы, 25. Шпатель для зубов, 26. скальпель, 27. ножницы, 28. ручная дрель, 29. отвертка, 30. Дрель с приводом от двигателя, 31. гнездовые соединители, 32. Гнездо tES, 33. квадратный платиновый электрод, прикрепленный к кабелю, паяльное соединение покрыто гистоакриловым клеем, 34. пластиковые винты. (В) впадина tES (красная) для фиксации на черепе грызуна с внутренним диаметром 4 мм; электродный блок (серый) состоит из винтовой крышки и внутренней штамповки с центральным отверстием, оставляющим место для кабеля дискового электрода Ag/Cl, который приклеен к нижней части штампа. Это обеспечивает максимальную стабильность установки и позволяет избежать обрывов проводов в чувствительной точке соединения провода-электрода.