Визуализация реакций коленчатых ганглиозных нейронов in vivo с помощью эпифлуоресцентной микроскопии

Аннотация

Источник: Fowler, B. E., et al. Визуализация кальция in vivo реакции коленчатых ганглиозных нейронов мыши на вкусовые стимулы. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео демонстрируется протокол доставки вкусовых добавок к хирургически обнаженному коленчатому ганглии у мыши, находящейся под наркозом, и использование флуоресценции GCaMP с эпифлуоресцентной микроскопией для визуализации нейронных реакций в режиме реального времени, что помогает в исследованиях обработки периферических вкусовых сигналов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Запустите tastant panel
   1. Используйте всасывание для удаления жидкости из колена. При необходимости можно разместить абсорбирующую точку, чтобы уменьшить просачивание и облегчить навигацию под микроскопом.
   2. Поместите животное на впитывающую прокладку под микроскопом. Найдите коленчатый ганглий: полезные ориентиры включают отверстие, оставленное в булле, отверстие в височной кости и седьмой нерв. Используя фильтр FITC/GFP (флуоресцеин изотиоцианат/зеленый флуоресцентный белок) на эпифлуоресцентном эндоскопе, проверьте наличие отдельных GCaMP-экспрессирующих коленчатых ганглиозных нейронов. 10-кратный объектив (рабочее расстояние 10 мм) обеспечит достаточное разрешение для отслеживания активности отдельных клеток, но также можно использовать 20-кратный объектив (рабочее расстояние 12 мм).
   3. Плотно поместите дозирующую иглу для вкусовой линии в рот животного. Поместите чашку Петри под рот животного, чтобы собирать жидкость.
   4. Убедитесь, что камера смотрит в поле зрения микроскопа. Синхронизируйте начало видеосъемки с началом презентации.
   5. Во время записи следите за реакцией, дрейфом и просачиванием в реальном времени.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1ml Шприц с люэровским замком	Fisher Scientific	14-823-30
27 калибр тупой дозирующей иглы	Fisher Scientific	NC1372532
абсорбирующие точки	Fisher Scientific	50-930-668
Acesulfame K	Fisher Scientific	A149025G
BD Аллергологи Лотки с постоянно прикрепленной иглой	Fisher Scientific	14-829-6D
Тупые ретракторы	FST	18200-09
Макетная плата	Thor Labs	MB8
Custom Head Post Holder	eMachineShop		Смотрите прикрепленный файл 202410.ems
Изготовленная на заказ металлическая головка Post	eMachineShop		Смотрите прикрепленный файл 202406.ems
Контроллер температуры постоянного тока	FHC	40-90-8D
Цифровая камера, sCMOS OrcaFlash4 Микроскоп	Установленный Hamamatsu	C13440
Дисекционный прицел	Leica	M80
Светодиодный источник холодного света	Leica Mcrosystems	KL300LED
Адаптеры для трубок Luer Lock 1/16"	Fisher	01-000-116
Микроскоп	Olympus	BX51WI
Мини-серия Оптические стойки	Thorlabs	MS2R Чашки
	Петри Fisher Scientific	FB0875713A
Сжатый воздух	Воздух	AI Z300
Самоклеящаяся маркировка Лента	Fisher Scientific	159015R
Силиконовая шланговая трубка для клапана 1/32" x 1/16" o.d. (на фут)	Automate Scientific	05-14
Snap25-2A-GCaMP6s-D	JAX	25111
Студенческие тонкие ножницы	Fine Science Tools	91460-11
Хирургический зонд	Roboz Surgical Store	RS-6067
Держатель хирургического зонда	Roboz Surgical Store	RS-6061
BD Intramedic Трубка	Fisher Scientific	22-046941
Двухступенчатый газовый регулятор	Airgas	Y12FM244B580-AG
Tygon виниловая трубка - 1/16"	Automate Scientific	05-11
Valvelink8.2 цифровой/ручной контроллер	Automate Scientific	01-18
Valvelink8.2 Система перфузионной системы с пережимным клапаном	Automate	Scientific 17-pp-54
Ксилазин	анас	NADA# 139-236