Техника рассечения иллюстрирует энуклеации глаза мыши для фиксации тканей для выполнения фенотипирование в высокой пропускной способности экранов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мышь глаз Энуклеация для удаленного высокой пропускной Фенотипирование
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мышь глаз является важной генетической модели для поступательного изучения человеческих болезней глазной. Blinding заболеваний человека, таких как дегенерация желтого пятна, фоторецептор дегенерации, катаракты, глаукомы, ретинобластома, и диабетической ретинопатии были обобщены в трансгенных мышей. 1-5 большинства трансгенных и нокаутных мышей были получены в лабораториях для изучения без глазных заболеваний, но сохранения генетических ресурсов между системами органов предполагает, что многие из тех же генов также могут играть определенную роль в развитии глаз и болезни. Таким образом, эти мыши представляют собой важный ресурс для открытия новых генотип-фенотип корреляции в глаза. Потому что эти мыши разбросаны по всему миру, трудно приобретать, сохранять, и фенотип их в эффективные, экономически эффективным образом. Таким образом, наиболее высокую пропускную способность экранов офтальмологической фенотипирование ограничены несколько мест, которые требуют на месте, глазные экспертизы для изучения глаза в живых мышей. 6-9 альтернативный подход, разработанный нашей лаборатории является методом для удаленного ткани приобретения, которые могут использоваться в больших или малых масштабах исследования трансгенных мышей глаза. Стандартизированных процедур для видео-хирургической передаче навыков, ткани фиксации и доставки позволяют любой лаборатории, чтобы собрать весь глаз от мутантных животных и отправить их на молекулярном и морфологическом фенотипирования. В этом видео статье мы представляем методы выяснять и передавать как нефиксированные и перфузии фиксированной глазах мышь для удаленного анализа фенотипа.
Протокол
1. Тупой диссекции: энуклеации глаза мышей в образцах незаписанных
- Растащить веки, чтобы улучшить экспозицию и доступ к заднему мира (глазного яблока) поверхности.
- Разместите изогнутый forcep повязки за (под) мира в орбиту (глазницы). Mahajan Sharptip соусом forcep является пользовательский инструмент с острыми концами, чтобы сделать этот шаг легче (см. материалы и реагенты таблицу).
- Закройте forcep и понять орбитальной соединительной ткани и зрительного нерва позади миру, стараясь при этом, чтобы избежать сжатия земного шара.
- Осторожно потяните вверх forcep и срывать глазного яблока с орбиты. Белые нитевидные ткани зрительного нерва.
- Поместите глаз в PBS. Использование 30-иглу, сделать один прокол рану сразу же позади лимба, вставив иглу 1-2 мм в глазное яблоко. Это позволяет фиксаторов, таких как глутаральдегида, которые в противном случае не может проникнуть в ткани глаза, непосредственно антер глаза. Создание этого прокола рана не может быть необходимым, если фиксаторы, такие как параформальдегид или спирт, способны диффундировать в глазных тканях интерес.
- Поместите весь глаз сразу в фиксатор для погружения фиксации.
2. Sharp Dissection: Энуклеация из следующих мыши фиксацией перфузии глаза
- Использование изогнутых Colibri forcep провести веко от мира.
- Orient изогнутые Уэсткотт рассечение ножницами параллельном мире, стремясь к задней части орбиты.
- Вырезать фиксированной соединительной ткани, которая окружает земной шар из нижнего, медиальная, начальника, и боковые стороны.
- Поместите изогнутые forcep позади мира, возьмитесь за соединительную ткань, не нажимая на земном шаре, и потяните вперед, чтобы выяснять глаз. С орбитальной соединительной ткани жесткая фиксация от перфузии, дополнительные резки тканей орбиты могут быть необходимы, чтобы полностью освободить шаре.
3. Фиксация и упаковка
Доставка основной ткани должны следовать вашей организации и почтовые службы, включая требования соответствующие этикетки и упаковки. Следующий протокол является примером грузить неинфекционной биологических образцов при комнатной температуре. Для этого требуется 3 слоя упаковки, но не класса A / B биологическим веществом или жидкостью этикетки азота.
- Поместите глаз в 5-мл флаконе сцинтилляционного стекла, по крайней мере 3-мл фиксатора, или пост-фиксатор буфера, если фиксация коротких. Написать идентификационный номер на крышке флакона и запечатать его с Parafilm.
- Место сцинтилляционные флаконы в биологическом образце транспортную тару. В нашем институте, например, в специальных контейнерах требует трех слоев: герметичный контейнер, в котором образец помещается, абсорбирующий слой среднего и защитным внешним слоем.
- Поставьте контейнер в пузырь-обертывание пакет, а затем в приложениеблуждал контейнерных перевозок лаборатории вместе с соответствующей документацией.
4. Представитель Результаты
Гистологическое исследование глаз может быть выполнено различными способами, включая гематоксилином и эозином, ферментативные обнаружения выражения, просвечивающей электронной микроскопии и иммуногистохимии. После погружения фиксации в 4% параформальдегид, ткани в парафин и подразделяются на микротоме. В высокой пропускной фенотипирование, мы анализируем ученик-оптический нерв, который разделов образцов всех типов тканей в глаза (рис. 1). Разделы ткани были также исследованы на LacZ выражении (рис. 2), просвечивающей электронной микроскопии клеточных органелл (рис. 3), и экспрессии специфических молекул антител (рис. 4).
В нашем методе отбора фенотип, это не было важно для поддержания ориентации глаз по отношению к носовой (медиальной угла глазной щели) и временные (Lateraл угла глазной щели) сторон. Есть как минимум два варианта, если глаза ориентация является необходимой. После энуклеации, мы применили свет прижигания к временному роговицы в 3:00 позицию с портативных устройств прижигания. Поражение очевидно, по гистологии и не теряются в процессе обработки, как гистологическое красками. Недостатком является то, что прижигание повреждения роговицы, которое может быть критическим ткани для исследования. Второй вариант требует квалифицированного анатом, которые могут идентифицировать глазных мышц вставками. В стереомикроскопа, определение нижней и верхней косой мышцы вставки отмечает низшие и высшие, и аспект земного шара. 3 с любой ориентации метод, важно отслеживать образца в правом или левом глазу. Вместе, это позволит точной ориентации миру до секционирования.
Рисунок 1. Мышь глаза гистологических изображений Afte Г удаленного сбора. Мыши глаза энуклеировали резкой расчлененности после перфузии фиксации с 4% параформальдегида. А. Ученик-оптический нерв разделе окрашивали гематоксилином и эозином показывает сохранение всех тканей подструктур. ON, зрительного нерва. (Зеленая шкалы = 500 мкм) B. большим увеличением зрения нормальной сетчатки показывает его слоистой структуры: РСК, ганглиозных клеток сетчатки; IPL, внутренний слой плексиформные; INL, внутренний ядерный слой; OPL, внешний слой плексиформные; ONL, внешний ядерного слоя (клетки фоторецептора) (стрелка); И.С., фоторецептор внутренний сегменты (стрелки); OS, наружных сегментов фоторецепторов, НПП, пигментный эпителий сетчатки, C, сосудистой оболочки. (Зеленая шкала бар = 50 мкм) C. По сравнению с нормальным сетчатки, этот образец тоньше из-за дегенерации фоторецепторов. ONL, IS, и ОС полностью отсутствуют (стрелка). (Зеленая шкала бар = 50 мкм)
"ALT =" Рисунок 2 "/>
Рисунок 2. LacZ экспрессии в трансгенных мышах. Глаза были энуклеировали тупым рассечением и погружают в 1 мг / мл X-гал решения (5 мМ K3Fe (CN) 6, 5 мМ K4Fe (CN) 6, 2 мМ MgCl2, 0,02% NP40 и 0,1% дезоксихолат натрия) в течение ночи при 37 ° C. Глаза были зафиксированы в 2% formaldehyde/0.2% глутарового альдегида в течение 30 минут и подразделяются на микротоме. X-гал продукта (синий) этикетки: А. мерцательного эпителия, Б. эпителия роговицы и С. ганглиозных клеток сетчатки (РГК) слой сетчатки. INL, внутренний ядерный слой; ONL, наружный ядерный слой.
Рисунок 3. Просвечивающей электронной микроскопии пигментного эпителия сетчатки (ПЭС). После тупой диссекции и создание прокола раны, глаза были зафиксированы погружением в 2,5% параформальдегид / 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М натрий-фосфатного буфера. Глаза были вторичdarily фиксировали в 1% осмия textroxide, постепенно обезвожен, и встроенный в смоле Spurr автора. Ткань была разрезе на 90 нм и помещают на медь слот сетей рассматривается в формвар и отображаемого помощью просвечивающего электронного микроскопа. Микрофотография показывает, наружных сегментов фоторецепторов нейросенсорной сетчатки, меланосом (M) в течение пигментного эпителия сетчатки, а также мембраны Бруха.
Рисунок 4. Иммуногистохимическое маркировки супероксиддисмутаза-3 (зеленый) у мышей стекловидного тела. Глаза были энуклеировали тупым рассечением и прошли погружения фиксации в 4% параформальдегид. Они заливали в парафин и секционного использованием микротоме. Срезы тканей инкубировали с кроличьими поликлональными SOD3 антисыворотки разводят 1:50. SOD3 выражение было обнаружить с помощью козьего анти-кроличий IgG (H + L)-Alexa Fluor 488 сопряженных вторичными антителами. Маркировка SOD3 показано в GREеп.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Большинство трансгенных мышей существуют в лабораториях, которые не рассматривают глаза. Наше видео техника иллюстрирует простой, стандартизированный метод для удаленной передачи хирургических навыков для оптимизации ткани приобретение из лабораторий с небольшим опытом работы с глазами. Это видео техника помогает преодолеть основные ловушки, в высокой пропускной способности фенотипирование, что использование ограниченного числа экспертов сайтов за счет нестандартных коллекции тканей и фиксацией методы, которые препятств...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Исследования по профилактике слепоты; Бартли J. Mondino MD, директор Jules Stein Eye Institute, Лос-Анджелесе, и Рамиро Рамиреса-Солис, Джеки белый, и Жанна Estabel в Sanger института Wellcome Trust генома Campus. Это исследование соответствует ARVO Заявление для использования животных в офтальмологический и визуальных исследований.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Имя | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| Изогнутые Туалетный Forcep | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip соусом forcep | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Изогнутые ножницы Westcott | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15 ° BD Beaver микрохирургические лезвия | Becton-Dickinson | 374881 | |
| 0,22 Тонкая Castroviejo наложения швов Пинцеты | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0,12 Colibri щипцы | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| 30-иглы | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Рыбак | 03-523-4 | |
| Parafilm | Рыбак | 13-374-10 | |
| Стекло сцинтилляционные флаконы | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, рН 7,4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% параформальдегид | Электрон наук микроскопии | 15700 | |
| 2,5% параформальдегид / 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М натрий-фосфатного буфера | Электрон наук микроскопии | 15700 и 16300 | Смешанные в лаборатории |
| 50% Глутаральдегид | Электрон наук микроскопии | 16300 | |
| 0,25% формвар | Электрон наук микроскопии | 15810 | |
| Полицейскийв слот сетки | Электрон наук микроскопии | M2010-CR | |
| 4% осмия | Электрон наук микроскопии | 19140 | |
| Anti-SOD3 антител | Abcam | Ab21974 | |
| Козьего анти-кролик Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Spurr вложения в смоле | Электрон наук микроскопии | 14300 |
Ссылки
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42, 517-525 (2002).
- Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).
- Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus. Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).
- Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology. Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).
- Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase. Science. 272, 1026-1029 (1996).
- Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness. Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
