Визуализация высвобождения нейротрансмиттеров с помощью флуоресцентных репортеров на основе клеточных нейротрансмиттеров

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. CNiFER Имплантация в кору головного мозга мыши

1. : Перед операцией стерилизуйте все хирургические инструменты в автоклаве. Подготовьте полустерильное поле к операции, протерев 70% этанолом и положив чистый лабораторный подгузник.
2. Подготовьте инъекционную пипетку CNiFER, потянув стеклянный капилляр (внутренний диаметр 0,53 мм) за вертикальный электродный съемник. Используйте пару щипцов No 5 с тонким наконечником, чтобы сломать кончик электрода до диаметра ~40 мкм.
   Примечание: Лучше всего это делать под микроскопом со стереозумом с помощью градусной сетки.
3. Обезболить взрослую мышь C57BL/6 (60-90-й день после рождения) изофлураном: 4% (v/v) для индукции и от 1,5 до 2,0% (v/v) для поддерживающей терапии. Используйте зажим для хвоста или пальца ноги, чтобы убедиться, что мышь полностью обезболивается.
   Примечание: Периодически перещипывайте и оценивайте подергивание усов на протяжении всей операции, чтобы повторно оценить глубину анестезии.
4. Накройте глаза офтальмологической мазью, чтобы предотвратить высыхание. Установите мышь в стереотаксическую рамку с ушными планками. Поддерживайте температуру тела мыши на уровне 37 °C с помощью грелки, регулируемой ректальным зондом.
5. Выбрейте участок размером примерно 5 мм на 12 мм с помощью электробритвы животного происхождения. Применяйте бетадин, а затем 70% (v/v) изопропанола. С помощью лезвия скальпеля разрежьте и снимите кожу с поверхности черепа. С помощью лезвия скальпеля удалите надкостницу с поверхности черепа. Обнажите и очистите поверхность черепа, как описано при стереотаксической хирургии.
6. Опустите пустую стеклянную пипетку в брегму и запишите передне-заднюю (A/P) и медиолатеральную (M/L) координаты. Обратившись к атласу мозга мыши, рассчитайте положение места инъекции. Переместите пипетку к целевому участку и отметьте череп для последующего формирования окна.
   Примечание: Место инъекции и окно зависят от изучаемой области и распределения проекций нейромедиатора или пептидного высвобождения в коре головного мозга. Например, в недавней публикации стереотаксические координаты от +1,0 до +2,0 мм А/и от +1,0 до +2,0 мм М/л были использованы для введения клеток CNiFER в лобную кору головного мозга для визуализации in vivo высвобождения дофамина во время классического кондиционирования.
7. Сформируйте окно с утонченным черепом размером 2 мм x 3 мм.
   Примечание: Кость в окне должна быть толщиной 15-20 мкм. Мелкие белые пятна в кости не должны быть заметны при увлажнении поверхности черепа, если кость достаточно истончена.
8. Поместите смоченную искусственную спинномозговую жидкость (ACSF) губку на окно, чтобы она оставалась влажной во время подготовки клеток к инъекции.
9. Соберите клон CNiFER, выращенный в колбе T75 до ~80% конфлюенции. Отсадите среду и промойте клетки стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS). Примечание: Трипсин для этих этапов не используется.
10. Удалите PBS и используйте 10 мл ACSF для выбивания клеток со дна колбы. Растирайте клетки для диссоциации клеточных скоплений. Центрифугируйте и ресуспендируйте гранулу в 100 μл ACSF. Центрифугируйте в течение 30 секунд при давлении 1 400 x g и удалите надосадочную жидкость, оставив гранулу покрытой ACSF. На этом этапе скопление клеток остается во взвешенном состоянии.
11. Заполните приготовленную на шаге 1.2 инъекционную пипетку минеральным маслом, загрузите пипетку на наноинъектор и продвинуте поршень, чтобы вытолкнуть небольшую каплю масла. Нанесите 5 мкл клеточной суспензии CNiFER на полоску пластиковой парафиновой пленки рядом с мышиным препаратом. Вставьте либо CNiFER, либо контрольные элементы CNiFER в вытянутую пипетку.
12. Переместите пипетку в целевые координаты X и Y, т. е. A/P и M/L, указанные в шаге 1.5. Опустите пипетку, прокалывая истонченный череп, и продолжайте опускаться на ~200-400 мкм ниже поверхности черепа, чтобы отложить клетки CNiFER в слоях 2/3 коры.
13. Введите ~4,6 нл клеток CNiFER в самое глубокое место с помощью наноинжектора, обратите внимание на движение на границе между маслом и клеткой, а затем подождите 5 минут, пока клетки выйдут. Извлеките пипетку ~100 мкм и введите еще ~4,6 нл ячеек CNiFER, подождите 5 минут. Затем медленно и осторожно извлеките пипетку, чтобы предотвратить обратный поток CNiFER. Повторите инъекции в один или несколько соседних участков.
14. Повторите шаги инъекции 1.8-1.12 с контрольными клетками HEK293 (т.е. клоном HEK293/TN-XXL/Gqi5, в котором отсутствует рецептор, сопряженный с G-белком [GPCR]). Разделите CNiFER и контрольные места инъекции клеток на ~200 мкм.
15. После завершения имплантации клеток промойте истонченное окно черепа с помощью ACSF и подождите, пока череп высохнет. Нанесите каплю цианоакрилатного клея (см. Материалы) на окно и быстро положите поверх клея предварительно вырезанное стерильное покровное стекло. Аккуратно прижмите защитное стекло к черепу на несколько секунд. Дайте клею высохнуть в течение 2 минут.
16. Заклейте края покровного стекла стоматологическим цементом и сформируйте вокруг окна углубление, чтобы удерживать воду для цели погружения.
17. Для обездвиживания головы мыши во время визуализации прикрепите за окном изготовленную на заказ перекладину с небольшой каплей цианоакрилатного клея. Дайте клею полностью высохнуть, а затем добавьте дополнительный стоматологический цемент для дальнейшего укрепления изготовленной на заказ перекладины.
18. Остальную поверхность черепа, за исключением окна, покрыть слоем стоматологического цемента. Убедитесь, что края кожи покрыты цементом, и дайте ему высохнуть в течение 20 минут.
19. После операции прекратите введение изофлурана и оставьте мышь на грелке в клетке до тех пор, пока она полностью не оправится от анестезии. Вводите 5% (в/об.) глюкозы в физиологическом растворе (подкожно [подкожно]) для регидратации и от 0,05 до 0,1 мг/кг бупренорфина (внутрибрюшинно [в/в], мгновенное высвобождение) для послеоперационной анальгезии.
    Примечание: Чтобы свести к минимуму потенциальную иммунологическую реакцию на CNiFER человека, ежедневно вводите мышке 20 мкл/100 г циклоспорина (в/в) за день до инъекции CNiFER.
20. Верните мышь в домашнюю клетку за едой и водой.

2. Визуализация клонов CNiFER in vivo

Примечание: Живая визуализация проводится на мышах с использованием двухфотонного микроскопа и аппарата, закрепленного за головой. Во время сеансов визуализации анестезия не требуется. При визуализации животных в бодрствующем состоянии ограничьте использование подголовника всего несколькими часами за раз, чтобы снизить уровень стресса. Возвращайте животное в домашнюю клетку между сеансами визуализации для еды и воды. Потенциальный стресс сводится к минимуму за счет затемнения света в комнате и окружающей части мыши в вольере.

1. На следующий день после операции установите мышь на платформу для визуализации, прикрутив металлическую перекладину для головы, имплантированную на череп, к раме для фиксации головы.
   Примечание: При визуализации мышей в сознании сеанс визуализации не должен превышать нескольких часов из-за потенциальной нагрузки, вызванной устройством подголовника.
2. Поместите платформу визуализации с мышью, удерживаемой в голове, в двухфотонный микроскоп с 10-кратным (0,30 NA) и 40-кратным (0,80 NA) объективами для погружения в воду.
3. Вставной фильтрующий куб для визуализации флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) (улучшенный голубой флуоресцентный белок [eCFP] и цитрин), который имеет дихроичное зеркало с длиной волны 505 нм и полосовые фильтры с длиной волны от 460 нм до 500 нм для измерения eCFP и от 520 нм до 560 нм для измерения цитрина.
4. Добавьте ACSF в скважину, содержащую окно с утонченным черепом, и опустите цель погружения в воду в ACSF. Используйте окуляр в сочетании с ртутной лампой и фильтрующим кубом зеленого флуоресцентного белка (GFP), чтобы определить поверхность коры головного мозга и сосудистой сети под окном.
   Примечание: Рисунок сосудистой сети помогает определить местоположение и визуализировать одну и ту же область в течение нескольких дней визуализации. Переключитесь на объектив 40-кратного погружения в воду, чтобы найти CNiFER, вручную сфокусировавшись на поверхности коры головного мозга над клетками с помощью фильтрующего куба GFP и ртутной лампы.
5. Настроен на двухфотонную визуализацию. Выберите подходящий путь света для двухфотонной визуализации. Для типичной коммерческой системы используйте программное обеспечение для переключения в режим двухфотонной визуализации и перенаправления света на фотоумножители (ФЭУ) в детекторах, не подвергающихся сканированию. Включите фемтосекундный импульсный лазер ближнего инфракрасного диапазона, выберите длину волны 820 нм и настройку мощности 5-15%.
   Примечание: 5% мощности обычно обеспечивают ~25 мВт на образце.
6. Установите напряжение PMT1 и PMT2 близко к максимальному значению, обычно 700-1000 В в зависимости от PMT. Установите коэффициент усиления на 1 для каждого канала и обнулите положение z для объектива.
7. Опустите объектив на расстоянии от ~100 до 200 мкм от поверхности коры головного мозга и запустите сканирование x-y. Отрегулируйте мощность лазера, коэффициент усиления и напряжение ФЭУ для каждого канала, т.е. eCFP и Citrine, чтобы оптимизировать отношение сигнал/шум флуоресценции CNiFER.
8. Используйте функцию масштабирования в программном обеспечении, чтобы ограничить изображение областью, содержащей ячейки CNiFER, а также фоновую область. Используйте скорость сканирования не более одного кадра каждые 2 секунды (0,5 Гц) со скоростью 4 μс на пиксель. Отрегулируйте усреднение линий для подходящего соотношения сигнал/шум, например, усреднение по 2 строкам Калмана.
9. Нарисуйте область интереса (ROI) вокруг ячеек CNiFER, окружив примерно 3–4 ячейки на плоскость. Настройте анализ средней интенсивности ROI в режиме реального времени. Начните сбор данных для мониторинга флуоресценции CNiFER с течением времени.
10. Сбор флуоресценции от CNiFERs до и во время экспериментальных манипуляций, например, электростимуляции, стимуляции каналродопсином-2 (ChR2), поведения, определенного пользователем.
11. Когда эксперимент с визуализацией будет завершен, верните мышь в ее домашнюю клетку. При необходимости повторяйте изображение в течение нескольких дней. При повторной визуализации клетки обращаются к ранее полученному изображению сосудистой сети с малым увеличением, чтобы вернуться к тому же полю визуализации (шаг 2.4).
    Примечание: Имплантированные CNiFER можно визуализировать в течение не менее 7 дней.