Микроинжекторидная система на основе микрофлюидов для комбинированной инфузии лекарственных препаратов и электрофизиологии

Аннотация

Источник: Vanegas, M. I., et al. Микроинжектородная система для комбинированной инфузии лекарственных препаратов и электрофизиологии. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется микрофлюидное устройство на основе микроэлектродов, которое подает лекарственный раствор через капиллярную трубку, используя раствор маркера на масляной основе для точного отслеживания объема и обеспечивая одновременную нейронную запись и инфузию лекарства.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Конструкция микроинжектора для стимуляции и записи (Рисунок 1a)

1. Измерьте длину канюли и зонда (в данном примере это наносенсор). Щуп должен быть длиннее канюли на длину, которую он должен выступать из кончика канюли (в зависимости от конструкции щупа), плюс примерно 2 см.
2. Под лупой или микроскопом (~10-кратное увеличение) загрузите зонд в канюлю; по возможности предпочтительно использовать обратную загрузку для защиты наконечника зонда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг, выполняемый вручную, является сложным. Рекомендуется потренироваться с микроэлектродом под лупой, прежде чем пытаться использовать реальный экспериментальный зонд.
3. Пропустите канюлю (содержащую зонд) через верхний наконечник, Т-образный и нижний наконечники.
   1. Если щуп представляет собой просто один провод без каких-либо креплений, загрузите его обратно в канюлю и вставьте сборку в Т-образный соединитель с нижнего наконечника. Верхняя часть канюли (сторона с плоским концом) должна быть расположена в середине Т-образного соединения, в нижней части, но не в верхнем наконечнике. Экспериментальный зонд или биосенсор должен выступать над верхней частью наконечника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовленные по индивидуальному заказу наконечники также могут быть изготовлены путем сверления отверстия в пробках наконечника с помощью микросверла, размер отверстия зависит от диаметра, необходимого для затяжки канюли к Т-образному соединению.
4. С помощью наконечника затяните наконечники в верхней и нижней части Т-образного соединения. Не затягивайте слишком сильно. Можно добавить небольшой кусок трубки для усиления опоры электрода в верхнем наконечнике.
5. Припаяйте золотые контакты к каждой из клемм щупа (сигнальная, заземляющая и т.д.), в соответствии со спецификациями щупа.
6. Отрегулируйте взаимное расположение зонда и канюли. Измерьте расстояние, на которое щуп выступает из канюли при увеличении, и отрегулируйте вручную с верхнего конца (щуп может свободно скользить в наконечниках).
7. Добавьте эпоксидный клей между золотыми штифтами и верхним наконечником, чтобы прикрепить щуп к наконечнику.
8. Открутите верхний наконечник, чтобы втянуть щуп внутрь канюли. Визуально подтвердите, что зонд полностью находится внутри канюли при увеличении.
9. Подсоедините инжектор к микроприводу.

2. Конструкция микроинжектора для инфузии лекарственных препаратов (Рисунок 1b)

1. Прикрепите «нескошенный» или плоский конец канюли к нижней части Т-образного соединения с помощью наконечника. С помощью гаечного ключа с наконечником затяните наконечник.
2. Прикрепите небольшой кусочек капиллярной трубки (~1,5 см) к верхней части Т-образного соединения, пропустив его через стандартный наконечник. Затяните с помощью гаечного ключа с наконечником.
3. Загрузите микроэлектрод обратно через капиллярную трубку, Т-образный переход, канюлю и соответствующие наконечники.
4. Убедитесь, что задний конец электрода выступает менее чем на 1 см от задней части капиллярной трубки, а кончик электрода выступает из канюли на нужном расстоянии с нижней стороны. Положение электродов можно регулировать вручную сверху.
5. Припаяйте золотой штифт к клемме микроэлектрода.
6. Добавьте эпоксидный клей между золотым штифтом и верхним наконечником, чтобы прикрепить микроэлектрод к наконечнику.
7. Открутите верхний наконечник, чтобы втянуть щуп внутрь канюли. Визуально подтвердить, что микроэлектрод полностью втянут в канюлю.

3. Построение микрофлюидного контура (Рисунок 2)

1. Поместите макетную плату на устойчивую поверхность. Расположите два трехходовых клапана параллельно самой длинной стороне макетной платы, примерно на 6 дюймов. Отдельно друг от друга, одним портом (тем, который всегда открыт) обращен друг к другу. С помощью винтов закрепите клапаны на макетной плате.
2. Поставьте рядом с клапанами линейку (для измерения и отслеживания движения жидкостей внутри капиллярной трубки).
3. Загрузите смесь масла низкой вязкости 1:1 и пищевого красителя (маркера) в газонепроницаемый шприц и поместите в насос для маркеров. Отрежьте один кусок капиллярной трубки и с помощью стандартных наконечников и разъемов Luer-lock подсоедините шприц к одному из портов входного клапана. Это и есть «маркерная линия».
4. Отрежьте короткий кусок капиллярной трубки для «линии линейки». Используйте стандартные наконечники для затяжки к торцевым отверстиям клапанов.
5. Отрежьте два более длинных куска капиллярной трубки, чтобы соединить выходной клапан с микроинжектором, а насос для лекарств — с входным клапаном (используйте стандартные наконечники).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Длина этих двух линий зависит от экспериментальной установки, одна должна быть достаточно длинной, чтобы добраться от инфузионного аппарата к животному, а другая — от фармацевтического насоса до входного клапана. С помощью раскалывающего камня разрежьте капиллярную трубку.

4. Установка микроинжектора на микропривод (Рисунок 3)

1. Перед установкой убедитесь, что микроэлектрод/экспериментальный зонд втянут в канюлю.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Направляющая трубка должна находиться в положении микропривода.
2. Прикрепите к микроинжектору изготовленный на заказ адаптер.
3. Сверху загрузите микроинжектор через направляющую трубку и закрепите его на адаптере с помощью винтов.
4. Измерьте положение (глубину) микропривода, в котором микроинжектор выступает из направляющей трубки, затем втяните его на ~1 см, чтобы подготовиться к введению.
5. Для экспериментов с микроинфузией подключите «мозговую линию» к неиспользуемому Т-образному отверстию микроэлектрода. Используйте стандартный наконечник и затяните его с помощью гаечного ключа.

5. Промывка и подготовка микрофлюидной системы

1. Расположите микропривод с микроинжектором над стаканом для отходов.
2. Загрузите хлоргексидин (например, нолвасан, растворенный при концентрации 20 г/л) в газонепроницаемый шприц объемом 1 мл и поместите его в насос для лекарств. Поверните направление потока клапанов таким образом, чтобы жидкость шла от насоса через клапан к клапанной линии и выходила из «мозговой линии».
3. Промойте контур хлоргексидином с низким расходом (50-200 мкл/мин) в течение минимум 10 мин. Повторите шаги с 5.2 по 5.3 стерильным физиологическим раствором, а затем продуйте воздух.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе важно проверить наличие утечек. Аккуратно нанесите безворсовые салфетки на места соединений, чтобы выявить любые утечки жидкости через наконечники.
4. Загрузите препарат в газоплотный шприц объемом 500 μл, сожмите воздух, а затем поместите в насос для лекарств. Расходуйте со скоростью 50 мкл/мин до тех пор, пока несколько капель не вытекут из микроинжектода.
5. Замочите направляющую трубку в хлоргексидине (растворенном при 20 г/л) на 15 минут.
6. Поверните направление выходного клапана в сторону «линии промывки». Продвигайте насос Маркер до тех пор, пока на линии линейки не будет виден четкий край цвета и масла. Следите за тем, чтобы между препаратом и цветом всегда было масло, чтобы не смешать два водорастворимых материала и не потерять острую грань между ними. Отметьте начальное положение этой линии масла/красителя (с помощью скотча или маркера).
7. Поверните направление выходного клапана в сторону мозговой линии.

6. Проведение записи или эксперимента по инфузии

ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы работы с животными будут варьироваться в зависимости от лаборатории и эксперимента. Следующие шаги должны быть выполнены после необходимой хирургической установки и подготовки к обнажению твердой мозговой оболочки. После эксперимента все необходимые постпроцедурные действия должны быть выполнены в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами.

1. Подключите микродисковод к камере записи. Опустите направляющую трубку, чтобы проникнуть в твердую мозговую оболочку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Направляющая трубка не должна проникать дальше твердой мозговой оболочки, чтобы не повредить кору головного мозга.
2. Опустите микроинжектор примерно на 2 мм над местом записи/инъекции в мозг.
3. Затяните верхний наконечник (выступающий микроэлектрод/биосенсор) и подключите золотые контакты к записывающей системе. Продолжайте продвигать микроинжектор к целевому участку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте включить в расчеты расстояние, на которое микроэлектрод выходит за пределы канюли.
4. Для экспериментов с инфузией используйте ручной микрошприцевой насос, чтобы перемещать столб масла на 1 см каждые 3 минуты (~60 нл/мин). После того, как желаемый объем будет залит, переключите выходной клапан в сторону линии промывки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем ввода будет варьироваться в зависимости от модели вида и целевой области мозга. Более высокая скорость потока может повредить нервную ткань.
5. Когда эксперименты будут завершены, втяните микроинжектор внутрь направляющей трубки (оставьте зонд выпяченным). Затем снимите микропривод для промывки. Промойте микрофлюидную систему, чтобы подготовить ее к повторному использованию. заметка: По нашему опыту, микроинжектор прослужит несколько использований при правильном уходе. Качество электрофизиологической записи падает быстрее, чем возможность инъекции.

Результаты

Рисунок 1: Пошаговое изготовление микроинжектора.) Конфигурация для использования независимо от микрофлюидной системы. Канюля и зонд измеряются для того, чтобы подтвердить, что кончик зонда может быть выдвинут на желаемую дли...

Материалы

https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 Разъемный вилка LabSmith (C360-101)https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 Накидной ключ LabSmith 1/8" шестигранный ключ для установки цельных фитингов и заглушек (шестигранный ключ LS-HEX 1/8") https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rshttps://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
3-портовые ручные клапаны	LabSmith	Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360)	https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26
Cannulae	Vita Needle Company	304 Трубка из нержавеющей стали, внешний диаметр 228 мкм, внутренний диаметр 165 мкм	https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf
Раскалывающий камень	Molex	Cbreaking stone 1" x 1" (деталь No 1068680064)	Настоятельно рекомендуется следовать методу расщепления капиллярных трубок: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf
Хлоррексидина диацетат		Дезинфицирующее средство Walmart Nolvasan (AAP311)	Используется для промывки микрофлюидных контуров, растворяется при 20 г/л
Пользовательский	адаптер Пользовательский поставщик-Изготовленный		на заказ адаптер для подключения микроинжектора к гидравлическому микроприводу
Драйвер	LabSmith	T7 TORX драйвер для установки шурупов макетной платы (LS-TORX Driver)	https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25
Эпоксидный клей	LabSmith	Двухкомпонентный высокопрочный эпоксидный клей (LS-EPOXY) для склеивания металла и пластика<	a href='https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#. XO8t89NKh24'>https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24
Наконечник	Цельный фитинг LabSmith	(C360-100) для подключения капилляров, сквозное отверстие размером для капилляра наружным диаметром 360 мкм
		для использования в любом порту -C360
Газоплотный шприц	Hamilton Company	500μL газоплотный шприц модель 1750 (81220) и 1мл газоплотный шприц модель 1001 (81320)	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top
Золотые штифты	Aim-Cambridge	Male позолоченные обжимной соединительный штифт (40-9856M)	https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html
безворсовые салфетки	Kimberly Clark Kimtech	Science Kimwipes Delicate Task	безворсовые салфетки, используемые для выявления утечек в системе
Жидкий пищевой краситель	McCormick & Co.	Черный жидкий пищевой краситель на водной основе (52100581873)	http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html
Соединитель Luer-Lock	LabSmith	Luer-Lock Adapter (C360-300), гнездовой штуцер для подключения шприца Luer Lock к капиллярной трубке	360μmhttps://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24
Микросверла	Grainger	Micro сверло, 0,23 мм (414H85)	https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits
Микроэлектрод	FHC	Металлический микроэлектрод, вольфрам с эпоксидной изоляцией	https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes
Масляный гидравлический микроманипулятор	Narishige Group	Масляный гидравлический микроманипулятор с прикрепленной направляющей трубкой (MO-96)	http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html
Капиллярная трубка Polymicro	Molex Polymicro	Гибкая капиллярная трубка из плавленого кремнезема (TSP150375), внешний диаметр 375 мкм, внутренний диаметр 150μm	https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf
Программируемый шприцевой насос	Harvard Apparatus	Standard Infuse/Withdraw Pump, программируемый (70-2213)
Ruler	Empire	Нержавеющая сталь 6" Жесткая линейка (27303)	http://www.empirelevel.com/rulers.php
Набор винтов	LabSmith	Набор крепежных винтов для клапанов (LS-SCREWS .25), винты для формирования резьбы (2-28 x 1/4") для крепления клапанов к макетной плате	https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24
Стандартная макетная плата	LabSmith	4" x 6" платформа (LS600), с расстоянием между отверстиями 0,25" для монтажа жидкостного контура	https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24
Стерильный физиологический раствор (хлорид натрия) 0,9%.	Baxter	0,9% хлорид натрия стерильный стерильный	внутривенный инфузионный
стерильный шприцевые фильтры	Millipore Sigma	MilliporeSigma™ Millex-GP™ Стерильные шприцевые фильтры с мембраной PES (SLGPM33RS)
Ручной микрошприцевой насос Stoelting	Company	Ручной инфузионный/отводящий насос (51222)	https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html
T-образный переход	LabSmith	Межблочный тройник (C360-203) для объединения потоков потока, для использования с капиллярными трубками наружным диаметром 360 мкм