Визуализация субклеточной динамики кальция в нейронах Caenorhabditis elegans

Аннотация

Источник: Doser, R., et al. Субклеточная визуализация обработки кальция в нейронах in vivo. J. Vis. Exp. (2023)

В этом видео in vivo демонстрируется визуализация субклеточного потока кальция в нейронах вентрального нервного канатика трансгенных штаммов Caenorhabditis elegans. Используются два различных показателя кальция: цитоплазматический индикатор у одного штамма и митохондриальный индикатор у другого. Нейроны наблюдаются под флуоресцентным микроскопом для мониторинга изменений интенсивности флуоресценции в цитоплазме и митохондриях нейронов в режиме реального времени, отражая поток кальция во время спонтанной активности нейронов.

Протокол

1. Подготовка червей для визуализации

1. Подготовка агаровых прокладок styles
   1. Приготовьте 3 мл 10% агара, растворив молекулярный агар в M9 в стеклянной пробирке для культуры размером 13 мм x 100 мм и разогрейте в микроволновой печи в течение нескольких секунд.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Расплавленный агар можно хранить на нагревательном блоке до 1 часа или делать свежим каждый раз, когда требуются агаровые прокладки.
   2. Поместите предметное стекло микроскопа между двумя дополнительными предметными стеклами, каждое из которых имеет два слоя лабораторной ленты (см. рисунок 1A-i).
   3. Отрежьте кончик наконечника для дозатора объемом 1 000 мкл (без фильтра) и с его помощью нанесите небольшую каплю агара на центральную защитную крышку (рис. 1A-i).
   4. Расплющите агар, нажав еще одну горку вниз на верхнюю часть агара (Рисунок 1A-ii).
   5. После охлаждения разрежьте агар на небольшой диск, используя отверстие стеклянной трубки для культуры размером 13 мм x 100 мм (рис. 1A-iii), а затем удалите окружающий агар.
2. Готовим раствор для скручивания червей
   1. Растворите порошок мусцимола в M9, чтобы получить бульон размером 30 мМ. Разделите на 50 мкл аликвот и храните при температуре 4 °C.
   2. Размораживайте новую аликвоту из 30 мМ мусцимола каждые 3-5 дней (и храните при температуре 20 °C во время использования).
   3. Разбавьте массу мусцимола 30 мМ в соотношении 1:1 с гранулами полистирола для получения раствора для скатывания.
3. Размещение червя для визуализации
   1. Поместите 1,6 μL раствора для скатывания в центр агаровой прокладки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество жидкости должно быть отрегулировано для визуализации молодых (меньше) или старых животных (больше).
   2. Используя предпочитаемый червячный медиатор (т.е. медиатор из стекла или платиновой проволоки), перенесите червя нужного возраста без фенотипа множественной вульвы в раствор для скатывания на агаровой прокладке (рис. 1A-iv). заметка. Репрезентативные данные получены от гермафродитов возрастом 1 день (штамм GCaMP6f = FJH185; штамм mitoGCaMP; FJH597), которые можно идентифицировать по наличию только одного ряда яиц.
   3. Подождите ~5 минут, пока мусцимол уменьшит движение червя, а затем опустите покровное стекло размером 22 мм x 22 мм на верхнюю часть агаровой прокладки, физически ограничивая движение червя.
   4. Для визуализации невритов в вентральном нервном канатике сверните червя в положение, показанное на рисунках 1B и 1C, слегка сдвинув покровное стекло.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы визуализировать вентральный нервный канатик, расположите червя головой вверх и перекатывайте червя до тех пор, пока кишечник не окажется с правой стороны проксимального отдела и слева для дистальной части червя (с точки зрения наблюдателя). Инвертируйте эту ориентацию (рис. 1C) для визуализации невритов в дорсальном нервном канатике.
4. Установка червячка на микроскоп
   1. Нанесите каплю иммерсионного масла на покровное стекло перед установкой его на предметный столик микроскопа.
   2. Найдите червя с помощью объектива с малым увеличением (10x) в светлом поле.
   3. Переключитесь на объектив 100x и отрегулируйте фокус.
   4. Определите местоположение неврита AVA с помощью подсветки GCaMP или mitoGCaMP с помощью лазера с длиной волны 488 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте небольшие регулировки, чтобы предотвратить сдавливание червя или стягивание покровного стекла.

2. Получение потоков изображений с высоким разрешением

1. In vivo GCaMP imaging
   1. Установите время экспозиции 20 мс.
   2. Отрегулируйте параметры лазера визуализации и сбора данных до тех пор, пока базальная флуоресценция GCaMP не окажется в среднем диапазоне динамического диапазона камеры. Обратитесь к обсуждению за предложениями по оптимизации параметров визуализации с использованием других установок микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптической установки, используемой в этом исследовании, установите лазер для визуализации с длиной волны 488 нм на следующие выходные настройки: мощность лазера = 50% и затухание = 1. Измените настройки сбора данных следующим образом: усиление ЭМ с умножением электронов) = 200 и усиление предварительного усилителя = 1.
   3. После того, как нейрит AVA будет расположен с помощью флуоресценции GCaMP при 100-кратном увеличении, установите корректор Z-дрейфа (ZDC, см. Таблицу материалов) в диапазоне ±30 мкм и запустите непрерывную автофокусировку. При необходимости вручную откорректируйте фокальную плоскость перед нанесением изображения.
   4. Получение потока изображений со 100-кратным увеличением. Длительность до 10 минут может быть достигнута с помощью установки, используемой в этом исследовании.
2. In vivo mitoGCaMP imaging
   1. Следуйте шагам 2.1.1-2.1.2 по мере необходимости, чтобы получить базальную флуоресценцию mitoGCaMP в среднем диапазоне для динамического диапазона камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для оптической конфигурации, используемой в этом исследовании, установите лазер для визуализации с длиной волны 488 нм на следующие выходные настройки: мощность лазера = 20% и затухание = 10. Измените настройки сбора данных следующим образом: усиление ЭМ = 100 и усиление предварительного усилителя = 2.
   2. После того как митохондрии в нейрите AVA будут расположены с помощью флуоресценции mitoGCaMP, установите ZDC, как описано выше на шаге 2.3.
   3. Получение потока изображений со 100-кратным увеличением.

Результаты

Рисунок 1: Установка и скручивание C. elegans для визуализации вентрального нервного канатика. (A) Иллюстрация шагов по приготовлению агаровых прокладок и сбору одного червя в раствор...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100x/1.40 Масляный объектив	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Объектив	Olympus		UPlanSApo
22 мм x 22 мм Покровное стекло	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
лабораторный стол CleanBench	TMC		С контролем вибрации
Фильтрующее колесо или ползунок	ASI		Для фильтров диаметром 25 мм
FJH 185	Генетический центр Caenorhabditis	FJH 185	Штамм червей
FJH 597	Генетический центр Caenorhabditis	FJH 597	Штамм червей
GFP полосовой эмиссионный фильтр	Chroma		525 ± 50 нм (диаметр 25 мм)
Лазерный объединитель ILE	Andor Technologies		4 лазерные линии
ILE твердотельный 488 нм лазер	Andor Technologies		50 мВт
IX83 Вращающийся диск конфокальный микроскоп	Olympus		С вращающимся диском Yokogawa CSU-X1 Вращающийся диск
iXon Ultra EMCCD камера	Andor Technologies
Низкофлуоресцентное иммерсионное масло	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Версия 7.10.1
Блок управления микроскопом	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
Полибисерные микросферы	Polysciences Inc.	00876-15	0,094 мкм
Камера стабильности	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Установлена на 15 °C
Контроллер сцены	ASI		С колесом фильтра
Стандартное предметное стекло микроскопа	Premiere	9108W-E	75 мм x 25 мм x 1 мм
Сенсорная панель Контроллер	Olympus		I3-TPC
Z-дрейфовый корректор	Olympus		IX3-ZDC2