Визуализация субклеточной динамики кальция в нейронах Caenorhabditis elegans

1. Подготовка червей для визуализации

1. Подготовка агаровых прокладок styles
   1. Приготовьте 3 мл 10% агара, растворив молекулярный агар в M9 в стеклянной пробирке для культуры размером 13 мм x 100 мм и разогрейте в микроволновой печи в течение нескольких секунд.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Расплавленный агар можно хранить на нагревательном блоке до 1 часа или делать свежим каждый раз, когда требуются агаровые прокладки.
   2. Поместите предметное стекло микроскопа между двумя дополнительными предметными стеклами, каждое из которых имеет два слоя лабораторной ленты (см. рисунок 1A-i).
   3. Отрежьте кончик наконечника для дозатора объемом 1 000 мкл (без фильтра) и с его помощью нанесите небольшую каплю агара на центральную защитную крышку (рис. 1A-i).
   4. Расплющите агар, нажав еще одну горку вниз на верхнюю часть агара (Рисунок 1A-ii).
   5. После охлаждения разрежьте агар на небольшой диск, используя отверстие стеклянной трубки для культуры размером 13 мм x 100 мм (рис. 1A-iii), а затем удалите окружающий агар.
2. Готовим раствор для скручивания червей
   1. Растворите порошок мусцимола в M9, чтобы получить бульон размером 30 мМ. Разделите на 50 мкл аликвот и храните при температуре 4 °C.
   2. Размораживайте новую аликвоту из 30 мМ мусцимола каждые 3-5 дней (и храните при температуре 20 °C во время использования).
   3. Разбавьте массу мусцимола 30 мМ в соотношении 1:1 с гранулами полистирола для получения раствора для скатывания.
3. Размещение червя для визуализации
   1. Поместите 1,6 μL раствора для скатывания в центр агаровой прокладки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество жидкости должно быть отрегулировано для визуализации молодых (меньше) или старых животных (больше).
   2. Используя предпочитаемый червячный медиатор (т.е. медиатор из стекла или платиновой проволоки), перенесите червя нужного возраста без фенотипа множественной вульвы в раствор для скатывания на агаровой прокладке (рис. 1A-iv). заметка. Репрезентативные данные получены от гермафродитов возрастом 1 день (штамм GCaMP6f = FJH185; штамм mitoGCaMP; FJH597), которые можно идентифицировать по наличию только одного ряда яиц.
   3. Подождите ~5 минут, пока мусцимол уменьшит движение червя, а затем опустите покровное стекло размером 22 мм x 22 мм на верхнюю часть агаровой прокладки, физически ограничивая движение червя.
   4. Для визуализации невритов в вентральном нервном канатике сверните червя в положение, показанное на рисунках 1B и 1C, слегка сдвинув покровное стекло.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы визуализировать вентральный нервный канатик, расположите червя головой вверх и перекатывайте червя до тех пор, пока кишечник не окажется с правой стороны проксимального отдела и слева для дистальной части червя (с точки зрения наблюдателя). Инвертируйте эту ориентацию (рис. 1C) для визуализации невритов в дорсальном нервном канатике.
4. Установка червячка на микроскоп
   1. Нанесите каплю иммерсионного масла на покровное стекло перед установкой его на предметный столик микроскопа.
   2. Найдите червя с помощью объектива с малым увеличением (10x) в светлом поле.
   3. Переключитесь на объектив 100x и отрегулируйте фокус.
   4. Определите местоположение неврита AVA с помощью подсветки GCaMP или mitoGCaMP с помощью лазера с длиной волны 488 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте небольшие регулировки, чтобы предотвратить сдавливание червя или стягивание покровного стекла.

2. Получение потоков изображений с высоким разрешением

1. In vivo GCaMP imaging
   1. Установите время экспозиции 20 мс.
   2. Отрегулируйте параметры лазера визуализации и сбора данных до тех пор, пока базальная флуоресценция GCaMP не окажется в среднем диапазоне динамического диапазона камеры. Обратитесь к обсуждению за предложениями по оптимизации параметров визуализации с использованием других установок микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптической установки, используемой в этом исследовании, установите лазер для визуализации с длиной волны 488 нм на следующие выходные настройки: мощность лазера = 50% и затухание = 1. Измените настройки сбора данных следующим образом: усиление ЭМ с умножением электронов) = 200 и усиление предварительного усилителя = 1.
   3. После того, как нейрит AVA будет расположен с помощью флуоресценции GCaMP при 100-кратном увеличении, установите корректор Z-дрейфа (ZDC, см. Таблицу материалов) в диапазоне ±30 мкм и запустите непрерывную автофокусировку. При необходимости вручную откорректируйте фокальную плоскость перед нанесением изображения.
   4. Получение потока изображений со 100-кратным увеличением. Длительность до 10 минут может быть достигнута с помощью установки, используемой в этом исследовании.
2. In vivo mitoGCaMP imaging
   1. Следуйте шагам 2.1.1-2.1.2 по мере необходимости, чтобы получить базальную флуоресценцию mitoGCaMP в среднем диапазоне для динамического диапазона камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для оптической конфигурации, используемой в этом исследовании, установите лазер для визуализации с длиной волны 488 нм на следующие выходные настройки: мощность лазера = 20% и затухание = 10. Измените настройки сбора данных следующим образом: усиление ЭМ = 100 и усиление предварительного усилителя = 2.
   2. После того как митохондрии в нейрите AVA будут расположены с помощью флуоресценции mitoGCaMP, установите ZDC, как описано выше на шаге 2.3.
   3. Получение потока изображений со 100-кратным увеличением.

Рисунок 1: Установка и скручивание C. elegans для визуализации вентрального нервного канатика. (A) Иллюстрация шагов по приготовлению агаровых прокладок и сбору одного червя в раствор для скручивания. (B) Пример положения червя перед его перемещением для визуализации. Красная стрелка указывает на необходимость крена червяка вправо, чего можно достичь, сдвинув покровное стекло вправо (синяя стрелка). Масштабная линейка = 50 мкм. (C) Правильная ориентация, необходимая для визуализации вентрального нервного канатика. Примечание: Кишечник находится с правой стороны от наблюдателя (с помощью вертикального микроскопа) в проксимальной половине, а затем с левой стороны в дистальной половине.