Количественная оценка дендритных шипиков с помощью конфокальной микроскопии

Аннотация

Источник: Gouder, et. al. Трехмерная количественная оценка дендритных шипиков из пирамидальных нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. J. Vis. Exp. (2015).

В этом видео демонстрируется визуализация и анализ дендритных шипиков в трансдуцированных, иммуномеченых пирамидальных нейронах с помощью конфокальной микроскопии. Фоновый шум уменьшается, а дендриты отслеживаются путем оценки их диаметра и длины. Автоматизированная сегментация позвоночника включает в себя задание параметров для размеров дендритов и шипов, а также классификацию шипов. 3D-модель создается и экспортируется для анализа.

Протокол

1. Культура нейронов

1. Обработать 6-луночные культуральные планшеты со стеклянными покровными стеклами поли-орнитином (разведенным до 1/6 в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS), исходная концентрация 0,01%) в течение ночи (O/N), с последующим тремя промывками в DPBS. Затем добавьте ламинин (исходная концентрация 1 мг/мл, разведенный в 500 раз в DPBS) в течение не менее 10 часов под проточный колпак.
2. Планшет и отправка нейральных стволовых клеток (НСК) с низкой плотностью (50 000 клеток/см2) в 6-луночных культуральных планшетах со стеклянными покровными стеклами в 3 мл питательной среды, состоящей из модифицированной орлиной среды/питательной смеси F-1....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
PD-PBS (1X), без кальция, магния и фенола Red	Gibco/ Life Technologies	14190169
раствор поли-L-орнитина Биореагент	Sigma Aldrich	P4957
Мышиный ламинин	Dutscher Dominique
N2 Supplement	Gibco/Life Technologies	17502048
B-27 Supplement b/o vit A (50X)	Gibco/ Life Technologies	12587010
DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-I	Gibco/ Life Technologies	31331028
Neurobasal Med SFM	Gibco/ Life Technologies	21103049
2-меркаптоэтанол	Gibco/ Life Technologies	31350-010
Pen-Steptomycin	Gibco/ Life Technologies	15140-122
GFP Rabbit Serum Polyclonal Антитела	Gibco/ Life Technologies	A-6455
Horse serum	Gibco/ Life Technologies	16050130
Alexa Fluor 488 Goat Anti-rabbit	Gibco/ Life Technologies	A11034
Поликлональное антитело к бета-бетаIII тубулину	Millipore	AB9354
Coverglass 13 мм	VWR	631-0150
Proextend Gold Реагент против выцветания avec DAPI	Gibco/ Life Technologies	P36931
Tween(R) 20 Bioextra, вязкая жидкость	Sigma Aldrich Chimie	P7949
Triton X-100	Sigma Aldrich Chimie	X100-100ML
Фибробласты человека	Coriell Cell Line Biorepository	GM 4603 и GM 1869	Coriell Institute for Medical Research, Камден, Нью-Джерси, США
Необходим конфокальный лазерный сканирующий микроскоп	Zeiss (Германия)	LSM 700
Imaris Software	Bitplane AG, Zurich	версия 6.4.0 Filament	Tracer и модули Imaris XT необходимы
Huygens Software	Huygens software, SVI, Netherlands	Pro версия	Опционально (для тестирования деконволюции)

354232