Количественная оценка дендритных шипиков с помощью конфокальной микроскопии

Аннотация

Источник: Gouder, et. al. Трехмерная количественная оценка дендритных шипиков из пирамидальных нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. J. Vis. Exp. (2015).

В этом видео демонстрируется визуализация и анализ дендритных шипиков в трансдуцированных, иммуномеченых пирамидальных нейронах с помощью конфокальной микроскопии. Фоновый шум уменьшается, а дендриты отслеживаются путем оценки их диаметра и длины. Автоматизированная сегментация позвоночника включает в себя задание параметров для размеров дендритов и шипов, а также классификацию шипов. 3D-модель создается и экспортируется для анализа.

Протокол

1. Культура нейронов

1. Обработать 6-луночные культуральные планшеты со стеклянными покровными стеклами поли-орнитином (разведенным до 1/6 в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS), исходная концентрация 0,01%) в течение ночи (O/N), с последующим тремя промывками в DPBS. Затем добавьте ламинин (исходная концентрация 1 мг/мл, разведенный в 500 раз в DPBS) в течение не менее 10 часов под проточный колпак.
2. Планшет и отправка нейральных стволовых клеток (НСК) с низкой плотностью (50 000 клеток/см2) в 6-луночных культуральных планшетах со стеклянными покровными стеклами в 3 мл питательной среды, состоящей из модифицированной орлиной среды/питательной смеси F-12 или DMEM/F12 компании Dulbecco, 2 флаконов (по 5 мл каждая) добавки N2, 2 флаконов (по 10 мл) добавки B27, 10 мл Pen-Streptomycin (Пенициллин = 10 000 ЕД/мл и Стрептомицин = 10 000 ЕД/мл), 1 мл 2-меркаптоэтанола (Стоковый раствор: 50 мМ) и ламинина (1/500), без факторов роста.
   КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Выполняйте этот этап осторожно, добавляя клетки с медленными вращательными движениями, чтобы уменьшить кластеризацию клеток.
3. Удалите питательную среду. Добавьте свежую среду N2B27, содержащую 2 мкг/мл свежего раствора ламинина, чтобы нейрон оставался прикрепленным на стеклянных покровных стеклах и не слипался. Меняйте среду каждые 3 дня. Оставьте немного оставшейся среды (200 μл) перед добавлением свежей среды, чтобы предотвратить высыхание клетки. В качестве альтернативы действуйте быстро и измените общий объем (3 мл).

2. Лентивирусная трансдукция

Примечание: Экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP) управляется промотором мышиной фосфоглицераткиназы (PGK). Для этого исследования титр вируса составлял 400 нг/мкл (стоковый раствор в фосфатно-солевом буфере (PBS) 1x).

1. Индуцировать человеческие плюрипотентные стволовые клетки или нейроны, полученные из iPSC, на любой стадии созревания вирусными частицами путем добавления 1 мкл исходного раствора, содержащего 40 нг лентивирусного вектора GFP, на культуральную лунку (6-луночные планшеты) и инкубировать в течение 48 часов в свежей питательной среде. Примечание: Для этого протокола продолжительность инкубации позволяет хорошо маркировать структуры позвоночника.

3. Примечание об иммунофлюоресценции

: С целью улучшения мечения всей морфологии позвоночника, иммунофлуоресцентное мечение проводили с использованием антитела против GFP в условиях пермеабилизации.

1. Удалить питательную среду и зафиксировать трансдуцированные клетки на покровных стеклах в 4% параформальдегиде на 10 мин при комнатной температуре или RT, затем промыть 3 раза в 1x PBS (по 10 мин).
2. Погрузите покровные стекла в PBS с добавлением 0,05% Triton (100x) и 10% лошадиной сыворотки на 1 час в RT, затем постирайте 3 раза в 1x PBS.
3. Добавьте 100 мкл 1x PBS с добавлением 4% лошадиной сыворотки и первичного антитела (1/1000), выращенного против GFP и разбавленного в 1000 раз на каждом покровном листе. Инкубируйте в темной коробке O/N при 4°C, затем промойте 3 раза 1x PBS.
4. Разведите конъюгированное антитело Alexa Fluor 488 (1/200) в PBS с добавлением 0,5% Tween 20 и инкубируйте в течение 1 часа в режиме ЛТ. Затем 3 раза промыть в 1x PBS и закрепить покровные стекла на предметных стеклах с помощью монтажного материала для флуоресцентной микроскопии.

4. Дендритная визуализация позвоночника

1. Выполните конфокальную визуализацию с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.
2. Выберите здоровые нейроны с пирамидальной морфологией и полной дендритной арборизацией и количественно оцените не менее 10 нейронов для каждого состояния из отдельных экспериментов. Количественное определение 60 - 100 мкм на дендрит.
3. Получение изображений с помощью объектива 40X oil NA = 1.3 и лазерной линии с длиной волны 488 нм для возбуждения GFP с типичной пиковой мощностью на уровне образца около 20 μВт. Установите размер пикселя около 80 нм для правильной выборки дендритных шипов.
   Примечание: Последующий анализ требует получения изображения, на котором шум не нарушает надлежащую сегментацию дендритов и шипиков. С помощью пространственной дискретизации и настроек мощности, упомянутых выше, мы обнаружили, что время пребывания пикселя в 3,15 мкс достаточно для сбора достаточного количества фотонов для построения такого изображения. Для тусклых образцов качество изображения можно улучшить, усреднив от 2 до 4 сканов. Для покрытия интересующей области может потребоваться приобретение нескольких XY-плиток, которые затем должны быть сшиты вместе перед обработкой.
4. Чтобы получить выборку всего объема нейрона, получите Z-стек с шагом Z в диапазоне от 150 нм до 300 нм, что даст от 20 до 30 Z-срезов.
   Примечание: Латеральное пространственное разрешение, достигаемое при этих настройках, составляет 234 нм, а осевое разрешение - 591 нм. Выбранная здесь выборка является адекватной, но поскольку осевое разрешение больше, чем наименьший размер шипов, которые должны быть изображены, анализ отдает предпочтение шипам, которые отходят латерально от дендритов.

5. 3D Количественная оценка дендритных шипиков

Примечание: В следующих разделах конкретно описывается использование программного обеспечения Imaris для анализа. Существуют альтернативные реализации, в том числе NeuronStudio или Metamorph, которые могут обеспечить аналогичные результаты.

Используйте следующие ключевые настройки:

1. В качестве этапа предварительной обработки используется фильтрация по Гауссу с помощью средств обработки изображений, предлагаемых программным обеспечением. Выполните фильтрацию по Гауссу с помощью Обработки изображений > Сглаживания > Фильтра Гаусса. Установите ширину фильтра равной размеру пикселя в XY.
2. Выполните полуавтоматическую трассировку дендритов с помощью модуля Filament Tracer программного обеспечения.
   1. Во-первых, оцените диаметр дендрита с помощью инструмента расстояния на вкладке «Срез» программного обеспечения.
   2. На вкладке «Превзойти» нажмите на инструмент «Нити». Для большей надежности этот протокол полагается на полуавтоматическое отслеживание; нажмите на Пропустить автоматическое создание. В интерфейсе модуля теперь отображается вкладка «Рисование». Здесь выберите метод AutoPath, тип Dendrite и введите предполагаемый диаметр дендрита.
   3. Используйте режим Select указателя, превратив курсор в прямоугольник. Щелкните правой кнопкой мыши по начальной точке дендрита, удерживая клавишу Shift. Примечание: Программное обеспечение выполняет первоначальные расчеты.
   4. Перемещаем указатель вдоль дендрита. От начальной точки (представленной в виде синей сферы) отображается желтая линия, представляющая наиболее вероятный путь дендритов. Щелкните левой кнопкой мыши по конечной точке дендрита, удерживая клавишу Shift.
3. Выполните автоматическую сегментацию шипов. Примечание: Шипы на трассированном дендрите должны быть найдены автоматически интерфейсом модуля.
   1. В интерфейсе модуля нажмите на вкладку Создание. В выпадающем списке Перестроить выберите Перестроить диаметр дендрита и установите флажок Сохранить данные. Затем нажмите кнопку Перестроить.
   2. Установите Порог так, чтобы сегментированный объем соответствовал фактическому объему дендритов. В качестве алгоритма выберите кратчайшее расстояние на карте расстояний. Нажмите кнопку «Далее».
   3. Определите наименьший диаметр головки позвоночника и максимальную длину, опять же с помощью инструмента расстояния на вкладке «Срез» программного обеспечения, затем вернитесь на вкладку «Превзойти» и введите параметры. Для этого протокола хорошими отправными точками являются значения около 200 - 300 нм для минимального диаметра и 4 мкм для максимальной длины. Не устанавливайте флажок «Разрешить шипы ветвей». Нажмите кнопку «Далее».
   4. Отрегулируйте порог начальных точек таким образом, чтобы синие точки, представляющие шипы, локализовались относительно реальных головок шипов. Нажмите кнопку «Далее». Примечание: Расчет керна завершен и может занять много времени.
4. Классифицируйте корешки, перейдя на вкладку «Инструменты» интерфейса модуля. Нажмите на кнопку «Классифицировать шипы». В запрашиваемом пользовательском интерфейсе убедитесь, что есть четыре класса, определяемых по их морфологии следующим образом: Stubby: длина <1 μм; Гриб: длина (позвоночник) >3 и максимальная ширина (голова) >средняя ширина (шея) х 2; Длинный тонкий: Средняя ширина (голова) ≥ Средняя ширина (шея); Филоподиевидный: длина ≤ 4 мкм (без головки). Примечание: Интерфейс модуля генерирует четыре новых объекта Filament, содержащих результаты классификации.
5. Экспорт статистических данных: в любом из этих четырех объектных интерфейсов перейдите на вкладку «Статистика». Нажмите на кнопку «Экспортировать всю статистику в файл».
   Примечание: Другие статистические значения могут быть экспортированы для дендритов (например, длина, площадь, средний диаметр, глубина ветви, угол ветвления, объем и т. д.) и шипов (например, прямота, площадь прикрепления, длина и объем отдельных частей шипа, диаметр шипа, плотность и т.д.).

Материалы