Данная статья представляет собой надежный протокол для изоляции и культуры нервного гребня стволовых клеток из человеческого волоса.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и культуры нервного гребня стволовых клеток из человеческих волоса
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Волосяные фолликулы растут на протяжении всей жизни, а цикл роста волос представляет собой строго регулируемый процесс, включающий пролиферацию и стадию покоя стволовых клеток. Выпуклость волосяного фолликула (hair bulge) является хорошо изученной нишей для взрослых стволовых клеток1. Этот сегмент наружного корневого влагалища содержит несколько различных типов стволовых клеток, включая эпителиальные стволовые клетки2, стволовые клетки меланоцитов3 и стволовые клетки, подобные клеткам нервного гребня4-7. Волосяные фолликулы являются доступным и богатым источником различных типов стволовых клеток человека. Нами и другими авторами были выделены стволовые клетки нервного гребня (NCSCs) из волосяных фолликулов плода и взрослого человека4,5. Эти стволовые клетки человека являются клетками, удерживающими метку, и способны к самообновлению посредством асимметричного деления клеток in vitro. Они экспрессируют маркеры незрелых клеток нервного гребня, но не маркеры дифференцировки. Наше исследование профилей экспрессии показало, что они имеют сходный паттерн экспрессии генов с незрелыми клетками нервного гребня кожи мыши. Они проявляют клональную мультипотентность, что позволяет им давать начало миогенным, меланоцитарным и нейрональным клеточным линиям после клонального культивирования единичных клеток in vitro. Дифференцированные клетки не только приобретают специфические для данной линии маркеры, но и демонстрируют соответствующие функции в условиях ex vivo. Кроме того, эти NCSCs проявляют потенциал дифференцировки в направлении мезенхимальных линий. Дифференцированные нейрональные клетки могут сохраняться в мозге мыши и удерживать маркеры нейрональной дифференцировки. Было показано, что NCSCs, полученные из волосяных фолликулов, могут способствовать регенерации нервов и улучшать двигательную функцию у мышей, которым эти стволовые клетки были трансплантированы после перерезки спинного мозга8. Кроме того, с помощью трансплантатов стволовых клеток удалось восстановить периферические нервы9, а имплантация предшественников, полученных из кожи, рядом с раздавленными седалищными нервами привела к ремиелинизации10. Таким образом, NCSCs, полученные из волосяных фолликулов/кожи, уже показали многообещающие результаты для регенеративной терапии в доклинических моделях.
Перепрограммирование соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволловые (иПС) клетки продемонстрировало огромный потенциал для регенеративной медицины. Однако с иПС-клетками все еще связано множество проблем; в частности, недостаточно изучены долгосрочный эффект интеграции онкогенов/вирусов и потенциальная туморигенность плюрипотентных стволовых клеток. Прежде чем иПС-клетки смогут быть использованы в регенеративной медицине, необходимо преодолеть еще множество препятствий. В то же время взрослые стволовые клетки известны своей безопасностью и на протяжении многих лет применяются в клинике, например, при трансплантации костного мозга. Многие пациенты уже получили пользу от такого лечения. Аутологичные взрослые стволовые клетки по-прежнему являются предпочтительными клетками для трансплантации. Таким образом, легкодоступные и способные к экспансии взрослые стволовые клетки кожи и волосяных фолликулов человека представляют собой ценный источник для регенеративной медицины.
Протокол
1. Подготовка пластин тканевой культуры
- Пальто каждую лунку с достаточно поли-D-лизин (PDL), чтобы покрыть дно скважины. Разрешить пластин для просушки на капоте.
- После того, как скважины сухие, промыть стерильной водой и аспирации. Разрешить пластин для просушки на капоте.
- При сухой, пальто с фибронектин (который растворяют в воде BioWhittaker течение ночи при 37 ° C при концентрации 1 мг в 6 мл).
- Добавить NCSC среды [95 мл DMEM/F12, 1 мл Penn / Strep (P / S), 1 мл N2, 2 мл B27, 100 мкл меркаптоэтанола (2ME, 50 мМ), шФРФ (20 нг / мл среды), IGF -1 (20 нг / мл среды) и ЭФР (20 нг / мл среды)] до фибронектина сухой плиты,
2. Извлечение клетки волосяного фолликула от головы человека
- Перед началом процедуры выделения NCSCs, нужно подготовить соответствующие СМИ и реагентов (см. Таблицу 1).
- Свежий взрослого человека кожа головы от подтяжку лица процедуры или FeТаль тканей волосистой части головы собирают, промывают PBS, содержащих пенициллин, стрептомицин.
- Кожа затем переносят в 50 мл пробирок и инкубируют в DMEM с диспазы (10 мг / мл) в течение ночи при 4 ° C. Инкубация в течение 2-4 ч при 37 ° C является также эффективным. Кожа частей должна быть максимальной шириной 1 см, чтобы обеспечить фермента проникнуть.
- Передача кожу в стерилизованные чашки Петри; снять каждый волос с поверхности кожи, держа волос у поверхности кожи и потянув твердо и гладко. Волосяные фолликулы показать морфологии либо анаген (рис. 1А) или телоген (рис. 1б).
- Инкубируйте отдельные фрагменты фолликула в 0,05% трипсина-EDTA (Invitrogen) в течение 15-20 мин при комнатной температуре при встряхивании периодически добавляют 4 мл DMEM с 10% FBS, чтобы остановить реакцию. Фолликулярного эпителия трипсином и фильтруют через 40 мкм фильтр для получения одного-клеточной суспензии, содержащей клетки различного размера и формы.
- Спинпри 200 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант осторожно, повторно приостанавливать в 1 мл PBS, содержащим 2% сыворотки (FBS).
- Кроме того, сорвал волосяные фолликулы могут быть помещены в культуре без трипсина пищеварения расти волосы сферы на местах.
3. Выделение волосяной фолликул NCSCs помощью проточной цитометрии сортировки клеток
- Волосяной фолликул одной клеточной суспензии были получены путем расщепления трипсином и меченные антитела к CD271 (APC-сопряженными) / HNK1 (FITC-конъюгированных), или CD271 / alpha4 интегрина (PE-сопряженных) в течение 40 минут на льду в темноте.
- Центрифуга в течение 5 мин при 200 мкг при комнатной температуре и аспирации супернатант.
- Ресуспендируют клеток в PBS, содержащем 2% сыворотки (FBS), и перед сортировкой, PI прибавляется к воротам из мертвых клеток.
- Выполните сортировки клеток методом проточной цитометрии (FACS). Сбор CD271 +, HNK1 + двойной положительных клеток или CD271 +, alpha4 интегрина + двойной положительные клетки (рис. 2).
- После сортировкиING, CD271 +, HNK1 + двойной положительных клеток или CD271 +, alpha4 интегрина + двойной позитивные клетки культивировали в ультра-низким пластин вложения в NCSC среде
4. Культура первичной NCSCs
- Культура несогласие фолликулярных клеток или FACS отсортированных клеток в ультра-низких вложений пластин в NCSC среды, изменения средних каждый день.
- Проверьте культуре клеток каждый день под микроскопом. NCSCs начнет формировать плавающие малых агрегатов через несколько дней и хорошо сформированной сферы в 2-5 недели в культуре в зависимости от возраста доноров (рис. 3А). Результат появится через несколько дней в регионе выпуклость и хорошо сформированной сферы на месте в течение нескольких недель (рис. 3б), когда целые волосяные фолликулы культивируют в NCSC среды.
5. Расширение NCSCs
- Вымойте клетки с PBS раз.
- Добавить подогретого (до 37 ° C, критическое) accutase и инкубировать при 37 ° С в течение 5-10мин при встряхивании периодически, чтобы убедиться, что нейронные стволовые клетки сферах распадается на одну клетку (для крепления культурного NCSC, инкубировать клетки с accutase при 37 ° C в течение 5 минут, чтобы убедиться, что клетки волосяных фолликулов стволовых отделена).
- Вымойте и центрифуге клетках в два раза в течение 5 мин при 200 мкг при комнатной температуре в DMEM/F12 среде для удаления оставшихся решение accutase.
- Повторное приостановить клеток с NCSC культуральной среде.
- Для плавающего культуры, положить клеток в ультра-низким пластины крепления. Для крепления культуру, поставить в предварительно обработанные клетки пластины культуре ткани.
6. Представитель Результаты
NCSC культуральной среды является достаточным для поддержания hNCSCs в недифференцированное состояние без необходимости фидерных клеток. Кератиноциты не будет размножаться и постепенно умер в среду. Некоторые маленькие круглые клетки размножаются и образуют небольшие агрегатов в суспензии после 3 до 5 дней. Эти плавающие агрегаты медленно повышают яп размере, порожденный трехмерной сферы, как структуры, которую мы назвали волосы сферы (рис. 3А). Если культивировали в покрытых пластинами, NCSCs будет приложить к поверхности и не образуют сферы. Прилагаемый NCSCs расти быстрее, чем в суспензии. Сфере формирования и подключенными стволовых клеток выразить NCSCs маркеров. При всей фолликулы волос культуры, сферы формируются на области, соответствующей выпуклости области (рис. 3В).
Рисунок 1. Сорванные анаген (A) и телоген (B) волосяных фолликулов.
Рисунок 2. Представитель изображения FACS анализ NCSCs левой панели. Клетки закрытого использованием анти-CD271 и анти-Alphe 4 интегрина антителами. Справа: клетки закрытого использованием анти-CD271 и анти-антител HNK1.
Рисунок 3. Морфология волосы сферы (A) Морфология плавающей сферах волосы, левая панель. Низкой мощности, правая панель. Высокой мощности (B) Морфология волосы сферы на местах на Курской области, левой панели: волосы сфере на выпуклость телоген Правая панель: волосы сферы на Курской области волосяных фолликулов анагена.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Изолятор и культуру методами, описанными являются воспроизводимыми и надежной. Мы создали NCSCs из десятков лиц в широком возрастном диапазоне. Хотя лучше всего для обработки ткани сразу после сбора урожая ткани, мы обнаружили, что кожа головы тканей можно безопасно хранить в средствах массовой информации на льду в течение ночи транспорт с минимальным воздействием на жизнеспособность клеток.
Это важно для лечения кожи головы тканей с помощью антибиотиков и использовать асептики во время воло...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа выполнена при поддержке гранта NIH R01AR054593 и R01AR054593-S1 Сюй.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-32 | |
| Термоинактивированная FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| добавка B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| добавка N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0026 | |
| ЭФР (эпидермальный фактор роста) | R&система amp;D | 236-EG-01M | |
| ИФР-I | R&система amp;D | 291-G1-050 | |
| 0,05% трипсин/ЭДТА | Invitrogen | 25300-054 | |
| Диспаза | Invitrogen | 17105041 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Invitrogen | 15070063 | |
<сильный>Таблица 1. |
Ссылки
- Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
- Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell. 61, 1329-1337 (1990).
- Tanimura, S., et al. Hair follicle stem cells provide a functional niche for melanocyte stem cells. Cell Stem Cell. 8, 177-187 (2011).
- Yu, H., et al. Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles. Am. J. Pathol. 168, 1879-1888 (2006).
- Yu, H., Kumar, S. M., Kossenkov, A. V., Showe, L., Xu, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J. Invest. Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Wong, C. E., et al. Neural crest-derived cells with stem cell features can be traced back to multiple lineages in the adult skin. J. Cell Biol. 175, 1005-1015 (2006).
- Sieber-Blum, M., Grim, M., Hu, Y. F., Szeder, V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle. Dev. Dyn. 231, 258-269 (2004).
- Amoh, Y., et al. Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17734-17738 (2005).
- Koliatsos, V. E., Xu, L., Yan, J. Human stem cell grafts as therapies for motor neuron disease. Expert Opin. Biol. Ther. 8, 137-141 (2008).
- McKenzie, I. A., Biernaskie, J., Toma, J. G., Midha, R., Miller, F. D. Skin-derived precursors generate myelinating Schwann cells for the injured and dysmyelinated nervous system. J. Neurosci. 26, 6651-6660 (2006).
- LeDouarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. Cambridge. (1999).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Roh, C., et al. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 44, 236-244 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
