Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка Synaptoneurosomes от мыши Cortex использовании разрывных Перколла-Сахароза градиента плотности

32K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3196

⸱

17 сентября 2011 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin, 2Department of Biochemistry, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin

В этой статье

Краткое содержание

Метод подготовить трансляционно активных, неповрежденные synaptoneurosomes (SNS) из коры головного мозга мыши описано. Метод использует разрывные Перколла-сахарозы градиента плотности позволяет быстрого приготовления активных СН.

Аннотация

Synaptoneurosomes (SNS) получаются после гомогенизации и фракционирования коры мозга мыши. Они закрыты пузырьки или изолированных клемм, что оторваться от аксонов терминалов при корковой ткани гомогенизируют. СН сохранить пре-и постсинаптического характеристиками, что делает их полезными при изучении синаптической передачи. Они сохраняют молекулярные машины, используемые в нейронных сигналов и способны поглощать, хранение и высвобождение нейротрансмиттеров.

Производство и изоляции активных СН может быть проблематичным использование СМИ как Ficoll, которые могут быть цитотоксические и требуют более широкого центрифугирования из-за высокой плотности и фильтрации и центрифугирования методы, которые могут привести к низкой активности из-за механических повреждений СН. Тем не менее, использование разрывных Перколла-сахарозы градиенты плотности, чтобы изолировать СН обеспечивает быстрый метод получения хороших урожаев трансляционно-активных СН. Перколла-градиенте сахарозы метод быстр и нежные, как она использует изотонический условиях, имеет все меньше и короче спины центрифугирования и избегает шагов, которые центрифугирования гранулы СН и вызвать механические повреждения.

Протокол

1. Подготовка 1-4

  1. Подготовка 500 мл градиент среды (GM) буфера путем смешивания 50 мл 2,5 М раствора сахарозы, 2,5 мл 1М Трис-HCl, pH7.5 акций, и 0,1 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0 акции с милли- Q водой до полного объема. Фильтры стерилизовать решение, аликвоты и хранить замороженные.
  2. Подготовка 1000x запас тетродотоксин (TTX), сделав 1 мМ раствора в милли-Q H 2 O. Аликвоты ТТХ могут храниться при температуре -20 ° C.
  3. Подготовка 10x Буфер Стимуляция делая растворе 100 мМ трис (рН 7,5), 5 мМ Na 2 HPO 4, 4 мМ KH 2 PO 4, 40 мМ NaHCO 3, и 800 мМ NaCl в милли-Q воды. Склада, может храниться при 4 ° C.
  4. Предварительное охлаждение центрифуг до 4 ° C.
  5. Подготовка исходного раствора Isosmotic Перколла (SIP), добавив 9 томов Перколла (18 мл) до 1 объемом 2,5 М сахарозы (2 мл) в милли-Q воды и хорошо перемешать.
  6. Подготовка 3, 10, 15 и 23% слоев градиент путем добавления соответствующего количества SIP для GM буфера и смешивания каждого из них:

Таблица 0

  1. Залейте градиентом слоев с помощью пипетки 2 мл каждая из 23, 15, 10, 3% isosmotic решения Перколла в трубы центрифуги Beckman с колпачками использованием P1000 Gilson Pipetman. Интерфейс между слоями должны быть четко заметной без перемешивания слоев. Магазин градиентов при 4 ° С в течение по крайней мере 20 минут перед использованием. Градиенты могут храниться до 24 часов, хотя тот же день использования рекомендуется. [Неопытные сотрудники лаборатории могут практиковать подготовку градиенты, добавив синего красителя к isomotic решения Перколла для визуализации границ раздела слоев.]

2. Мышь рассечение 1

  1. Убедитесь, что все хозяйства мыши и эвтаназии процедуры выполняются в соответствии с НИЗ и Университета руководящих принципов. Эвтаназии щенков (возраст P13 на P21) углекислым газом удушья или метод одобрил в животном протокола.
  2. Pin мыши рассечение борту и брызг задней части шеи и головы с этанолом. Использование острыми ножницами прорезать спинного мозга в основании черепа, удалить кожу от верхней части черепа, разрезать череп с боков между теменной кости и кости межтеменной или между головного мозга и коры регионах. Затем вырежьте череп от основания к носу (вдоль сагиттальной шва), осторожно снимите мягкой теменной кости, потянув каждого полушария в сторону и снять кору с помощью шпателя. Вставьте шпатель в мозг выше мозжечка, а затем выкопайте коры и поместить его в ледяной буфера GM. Немедленно приступить к гомогенизации шаг. Не позволяйте коры сидеть в ледяной буфера очень долго, так как это отрицательно влияет на формирование СН.

3. Подготовка гомогената и СН 1-4

  1. Промыть коры в ледяной буфера GM и передача два коры на стакан Dounce гомогенизатор, содержащий 5 мл холодного буфера GM.
  2. Аккуратно гомогенизированный коры с 5-10 ударов свободные пестика (пестик ""), а затем на 5-10 ударов плотно пестиком (пестик "B"). Удары должны быть быстрыми, но достаточно медленно, чтобы не наносить воздушные пузыри. Картина гомогената после гомогенизации в схеме 1. Количество ударов будет варьироваться в зависимости от индивидуальных гомогенизатор и сопровождающих пестики. По окончании градиенты должны дать сильную полосу С.Н., если нет, регулировать количество ударов.
  3. Передача гомогената на 15 мл конические и центрифуге при 1000xg в течение 10 мин при 4 ° С в роторе размахивая ведром (Allegra 6KR центрифуги) в гранулах распада клеток и ядер. Изображение выделяемых гомогенат на схеме 1.
  4. Layer 2 мл супернатанта в Перколла-градиенте сахарозы, крышка трубы, и центрифуге при 32500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С фиксированным углом ротора (Beckman J2-21 центрифуг, JA-17 ротор) с помощью соответствующих адаптеров ( Смотрите Реактивы и оборудование таблицу).
  5. Внесите выходные и отбросить решение выше группы С. Н. использованием стеклянной пипетки Пастера. Внесите от группы С. Н. на 15/23% интерфейсом, перевод на конической и хранить на льду. Каждый градиент или один коры будет производить 0,9-1,1 мл SN.
  6. Отрегулируйте концентрации солей СН, добавив одну десятую объема буфера 10x стимуляции, добавить 1000x CaCl 2 до конечной концентрации 12 нМ, и добавьте 1 мМ ТТХ акции конечной концентрации 1 мкМ для подавления неспецифической возбуждения. (Добавление CaCl 2 не является обязательным, если он будет мешать течению приложений SN).
  7. Определение концентрации белка СН использованием белка Micro BCA Пробирной Kit. (Анализ Брэдфорд белок не рекомендуется из-за вывода из Перколла.)
  8. СН может быть использован непосредственно и быстро для белка трансляцииТион исследований. Для других приложений SN лизат может быть очищен или концентрированный использованием Пирс SDS-PAGE Пример Prep Kit.

4. Представитель результаты:

Когда мышь коры гомогенизировали и разделены на разрывной Перколла-сахарозы градиенты (Схема 1), 6 полос или фракции видели (рис. 1). Ранее было показано, для коры головного мозга крыс 3,5, что компоненты с высоким молекулярным весом полосы были сломаны мембраны и миелин и гранулированный материал, содержащийся или органеллы митохондрии (табл. 1). 23% / 15% интерфейс (группа 5), содержащиеся обогащенного СН.

Полоса 23% / 15% интерфейса, содержащего нетронутыми СН, был снят и исследовали с помощью электронной микроскопии (ЭМ), как описано выше. 2,6 EM показали наличие интактных синаптических пузырьков и сохранение пресинаптических и постсинаптических элементов (рис. 2). Выделение пре-и постсинаптического отсеков имеет важное значение для изучения сигнализации и синтез белка, который происходит в обоих отсеках. 7-13 Перколла-сахарозы градиент сырой очистки, чтобы мы увидели незначительных клеточном, ядерной и органелл загрязнения во фракции, но С. Н. общее разделение было хорошо.

Когда рассматривается пятно Западной, Перколла фракций, содержащихся ожидается маркеров белков с увеличением синаптических чистоты в группе С. Н. (рис. 3, таблица 2). Synaptic и нейронных маркеров были сохранены в группе обогащенного SN (группа 5), но обилие других маркеров была значительно уменьшена. В частности, наличие GFAP, маркером астроцитов и опухолевые клетки глии происхождения, а Ламин-B1, ядерных маркеров, были незначительны, в то время структурные и синаптических маркеров были сохранены и усилены. Кроме того, было сохранение маркеров для органелл, таких, как митохондрии и Гольджи, которые играют роль в синтезе белка.

Типичные дает для группы С. Н. были 250-500 нг белка на мкл, как это определено анализа белка ДСС. Деятельность СН определяли количество де синтез белка заново представить как контролируется [35С]-Met регистрации (рис. 4). 2 Базальные переводческой деятельности был увеличен 1,56 раз, когда СН были стимулированы с 50 мкМ glutamate/10 мкМ глицин (Glu), или 5,12 раза при активации с юглон ингибитор Pin1. Pin1 торможение, как известно, приводит к увеличению синтеза белка. 2 Чтобы подтвердить, что увеличение [35С]-Met включение было связано с де-синтез белка заново, мы добавили 40 мкМ anisomycin, ингибиторов синтеза белка, и увидел заметное снижение включения в присутствии и отсутствии Glu по сравнению с базальной уровнях. Кроме того, при добавлении 2% Triton-X 100, что нарушает целостность СН, базальных перевод был снижен на 75%. 2 Кроме того, при рассмотрении полос (В4-В6), которые показали самые синаптические маркер обогащения, СН или группы 5, наибольшую активность для вновь синтез белка (рис. 5). Таким образом, разрывные Перколла-сахарозы градиенты быстро создавать высокую активность и обогатил С. Н. группа, которая может быть использована для изучения трансляции белка.

Разрывных Перколла-градиенте сахарозы процедура является более выгодным, чем другие методы, поскольку механические повреждения вызвано более жесткими условиями. По сравнению с методом фильтрации, в котором очищается корковых гомогената пропускается через серию фильтров, которые уменьшаются в размерах, 3,14-15 Перколла метод формы более СН с большей активностью. Как видно на рисунке 6, когда аликвоту СН подготовленный метод фильтрации был передан Перколла-градиенте сахарозы Существуют гораздо менее СН на 15/23%, а интерфейс большее количество сломанной мембран. Когда заново синтез белка была измерена с помощью S35-мет регистрации, СН подготовленный метод фильтрации были гораздо менее активны (рис. 7). Чтобы максимально переводческой деятельности мы используем мышей, которые в возрасте между P14 и P18. С. Н. могут быть получены из взрослых мышей, но мы наблюдали значительно увеличили переводческой деятельностью с С. Н. приготовленный из несовершеннолетних мышей (рис. 8).

Таблица 1
Таблица 1. Составляющие группы из разрывных Перколла градиента фракционирования гомогенизированных коры мыши. 3,5

Таблица 2
Таблица 2. Резюме Западной анализ разрывных болтов Перколла-сахарозы трехсторонние градиент группы. Относительная концентрация белка для каждой группы фракций выделяли с помощью разрывных Percolл-градиенте сахарозы были определены иммуноблоттинга. Нет белок присутствует (-), 0 ≥ 0.2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), или> 0,8 (+++) раза больше, чем белки присутствуют в супернатант (S, центрифугируют гомогенат коры), представитель п = 3.

Схема 1
Схема 1: Схема подготовки SN использовании разрывных Перколла-сахарозы градиента плотности коре мозга мышей были вскрыты, гомогенизировали и центрифугировали при низкой скорости, чтобы удалить без гомогенизированной ткани, клетки, целые органеллы, такие как ядра и оболочки.. Разрывным градиентом должна иметь четко определенные слои. Вставке показана картина пример слоев, которые были окрашенных синим только для иллюстрации того, чтобы визуализировать слои. Супернатант слой поверх разрывных Перколла-градиенте сахарозы и центрифугировали при средней скорости. Группа С. Н. затем извлекается из градиента и готов к использованию.

Рисунок 1
Рисунок 1. Гомогената фракционирования на разрывной Перколла-градиенте сахарозы. Мышь коры гомогенизировали и разделены на разрывной Перколла-градиенте сахарозы что приводит к 6 полос или фракции. Очищенной, активная СН (*) были обнаружены в группе 5.

Рисунок 2
Рисунок 2. С. Н. подготовку дают разнородных СН, которые сохраняют пресинаптических и постсинаптических элементов. Электронная микрофотография подготовки SN приготовленный из C57BL / 6 мышей (возраст P13 на P21) проводили, как описано выше и показывает СН с сохраненной пресинаптические и постсинаптические элементы 2. , 6 Красная точка стрелки постсинаптической плотности. Шкала бар 1 мкм.

Рисунок 3
Рисунок 3. Западные анализы пятно препаратов С. Н. показал, что синаптические и нейронных маркеры сохраняются в очищенной СН (Band 5), но обилие других маркеров была значительно уменьшена. Иммуноблотов супернатанта (S, центрифугируют гомогенат коры) и Группы 1-6 из разрывных Перколла-градиенте сахарозы были исследованы для β-актина (структурные, загрузка контроль), GFAP (астроцитов), GP73 (Гольджи), HSC70 (цитоплазматических и ядерных) Ламин-B1 (ядерной), Prohibitin (митохондриальных), PSD95 (постсинаптической плотности ), SNAP25 (синаптической), Synaptophysin (синаптической) и β3-тубулина (нейрон-специфической). Полосы были визуализированы использованием Буря 860 Phosphorimager, представитель п = 3.

Рисунок 4
Рисунок 4. СН активны и обладают заново синтез белка через [35С]-Met регистрации. СН были заранее доведены до 37 ° С в течение 10 мин. Затем СН были неочищенных или предварительно в течение 15 мин с 40 anisomycin мкМ или 1 мкМ юглон при 37 ° С с последующим добавлением [35С]-Met, 20 мкл Express Pro Этикетка Mix S35 Легкая тегов, плюс-минус Glu при 37 ° С в течение 30 мин. Образцы были приготовлены с использованием Пирс SDS-PAGE Пример Подготовка комплекта, работает на 15% полиакриламидном геле, высушивают и количественно использованием молекулярной динамики Буря 860 phosphorimager, представитель п = 3, ± SEM.

Рисунок 5
Рисунок 5. Группа 5 из разрывных Перколла-градиенте сахарозы, содержащейся высокий уровень де синтез белка заново. Группы 4, 5 и 6, а супернатант (S, центрифугировали корковых гомогената) были заранее доведены до 37 ° С в течение 10 мин. Тогда, [35S]-Met, Express Pro Этикетка Mix S35 Легкая Tag, был добавлен, плюс-минус Glu при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Образцы были приготовлены с использованием Пирс SDS-PAGE Пример Подготовка комплекта, работает на 15% полиакриламидном геле, высушивают и количественно использованием молекулярной динамики Буря 860 phosphorimager, представитель п = 3, ± SEM.

Рисунок 6
Рисунок 6. СН приготовленный из метод фильтрации содержат больше сломанной мембран и менее чем в целом СН СН приготовленный из разрывных Перколла-сахарозы градиентным методом. СН были подготовлены, передавая гомогенизированный коры через серию фильтров с уменьшением размера пор, как описано выше. 3,14-15 аликвоту СН подготовленный метод фильтрации центрифугировали над разрывным Перколла-градиенте сахарозы и по сравнению с эквивалентным количеством материала с помощью разрывных Перколла-сахарозы градиентным методом.

Рисунок 7
Рисунок 7. СН приготовленный из метод фильтрации содержат меньше заново синтез белка активность, чем СН подготовлены сюдам разрывных Перколла-сахарозы градиентным методом. СН были подготовлены, передавая гомогенизированный коры через серию фильтров с уменьшением размера пор, как описано выше, 3,14-15 и разрывных Перколла-сахарозы градиентные методы. СН от обоих препаратов, предварительно уравновешенной до 37 ° С в течение 10 мин. Тогда, [35S]-Met, Express Pro Этикетка Mix S35 Легкая Tag, был добавлен, плюс-минус Glu при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Образцы были приготовлены с использованием Пирс SDS-PAGE Пример Подготовка комплекта, работает на 15% полиакриламидном геле, высушивают и количественно использованием молекулярной динамики Буря 860 phosphorimager, представитель п = 3, ± SEM.

Рисунок 8
Рисунок 8. СН от молодых мышей (P14) обладают большей активностью, чем поступательного старых мышей (P85). СН были получены из различных старых мышей использовании разрывных Перколла-сахарозы градиентный метод, preequilibrated при температуре 37 ° С в течение 10 мин, обработанных и необработанных с Glu в Наличие [35С]-Met (Express Pro Этикетка Mix S35 Легкая тегов) в течение 30 мин, оснастки заморожены, а затем очищается с Пирсом SDS-PAGE Kit Подготовка проб. СН были выполняться на 12% SDS-полиакриламидном геле, высушивают и отображается на молекулярной динамики Буря 860 phosphorimager, представитель п = 3, ± SEM. СН от P14 мышей, по крайней мере в 3 раза более активен, чем P85 мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Разрывных Перколла-градиенте сахарозы подготовки описаны в настоящем документе, быстрый, надежный способ, чтобы изолировать активных СН, который может быть использован в разнообразных экспериментах синаптической передачи. Этот градиент метод, который основан на методике, разработанной Данкли и соавт., 3,4 является субклеточных процедуре фракционирования мозга, которая изолирует как до, так и постсинаптические мембраны полученных пузырьков, которые связаны друг с другом. Без дальнейшей очистки этих СН совмести...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить BK августа из Университета Висконсин-Мэдисон Фонда электронного микроскопа для электронной микроскопии. Эта работа была поддержана грантами NIH R01-DA026067 и P30-HD03352 (для JSM).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (необязательно)
Micro BCA белка Пробирной Kit Проколоть 23235
CaCl 2 Рыболов C79-500
СО 2 Airgas (UW-MDS) CD 50
ЭДТА RPI E57020
EtOH Рыболов A407SK-4
HCl Рыболов A142-212
Перколла GE Healthcare 17-0891-01
KH 2 PO 4 Рыболов P285-500
PierceSDS-PAGE Пример Prep Kit Проколоть 89888
NaCl RPI S23020
NaHCO 3 Рыболов BP328-500
Na 2 PHO 4 Рыболов S381-500
Сахароза RPI S24060
Трис базы RPI T60040
Тетродотоксин Сигма T5651
Express Pro Этикетка Mix S35 Легкая тегов Перкин Элмер NEG772
Оборудование Компания Номер в каталоге Комментарии (необязательно)
Dissection инструменты
Dounce гомогенизатор, 7 мл (поставляется с двумя стеклянными пестики с надписью "А" и "B") Уитон
P1000 Gilson Pipetman Gilson F123602
Аллегра 6KR Центрифуга Beckman Coulter 366830
GH 3,8 Ротор, Бакет ротор Beckman Coulter 360581
Beckman J2-21 Центрифуга Бекман
Бекман труб с колпаками Бекман 355672
Белые стены адаптеры Бекман 342327
Синие стены адаптеры Бекман
JA-17 Ротор с фиксированным углом ротора Бекман 369691

Таблица антител, применяемых для западных пятна:

Название антител Компания Номер в каталоге Хост видов Коэффициент разбавления
β-актин Сигма A5441 мышь 1:2000
GFAP Санта-Крус SC-65343 мышь 1:200
GP73 Санта-Крус Sc-134509 кролик 1:200
HSC70 Санта-Крус SC-7298 мышь 1:200
Laminβ Санта-Крус Sc-6261 козел 1:200
Prohibitin Санта-Крус SC-28259 кролик 1:200
PSD95 Millipore MAB1596 мышь 5 мкг / мкл
SNAP25 AbCam ab5666-100 кролик 1:2000
Synaptophysin Millipore MAB368 мышь 1:500
β-3-тубулина Санта-Крус SC-80016 мышь 1:200

Ссылки

  1. Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
  2. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis. Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).
  3. Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Res. 441, 59-71 (1988).
  4. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  5. Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes. J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).
  6. Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level. J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).
  7. Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow. Front. Neural Circuits. 3, (2009).
  8. Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis. Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).
  9. Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49, 349-356 (2006).
  10. Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation. J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).
  11. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity. J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).
  12. Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology. J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).
  13. Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry. J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).
  14. Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals. J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).
  15. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes. Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).
  16. Billard, J. M. Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium. Magnes Res. 19, 199-215 (2006).
  17. Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice. Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).
  18. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels. J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
  19. Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development. Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).
  20. Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo. Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).
  21. Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses. Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).
  22. Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus. J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).
  23. Weiler, I. J., Greenough, W. T. Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).
  24. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J. Anat. 96, 79-88 (1962).
  25. Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex. Cytometry A. 60, 90-96 (2004).
  26. Hajós, F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity. Brain Res. 93, 485-489 (1975).
  27. Bai, F., Witzmann, F. A. Synaptosome Proteomics. Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).
  28. Rao, A., Steward, O. Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes. J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).
  29. Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. Methods of Cell Separation. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).
  30. Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. High affinity uptake of L-glutamate and γ-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster. J. Biosci. 11, 119-135 (1987).
  31. Munteanu, L. S., Dinu, A. Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints. Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).
  32. Cell separation composition, kit and method. US patent. , 019713 (1997).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Градиент Перколл-сахарозацентрифугирование в градиенте плотностивыделение синаптосомвестерн-блот-анализвключение S35-метионинаисследования трансляции белковзахват синаптических везикулвысвобождение нейромедиаторов
Подготовка Synaptoneurosomes от мыши Cortex использовании разрывных Перколла-Сахароза градиента плотности
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.