Подготовка Synaptoneurosomes от мыши Cortex использовании разрывных Перколла-Сахароза градиента плотности

Summary

Метод подготовить трансляционно активных, неповрежденные synaptoneurosomes (SNS) из коры головного мозга мыши описано. Метод использует разрывные Перколла-сахарозы градиента плотности позволяет быстрого приготовления активных СН.

Abstract

Synaptoneurosomes (SNS) получаются после гомогенизации и фракционирования коры мозга мыши. Они закрыты пузырьки или изолированных клемм, что оторваться от аксонов терминалов при корковой ткани гомогенизируют. СН сохранить пре-и постсинаптического характеристиками, что делает их полезными при изучении синаптической передачи. Они сохраняют молекулярные машины, используемые в нейронных сигналов и способны поглощать, хранение и высвобождение нейротрансмиттеров.

Производство и изоляции активных СН может быть проблематичным использование СМИ как Ficoll, которые могут быть цитотоксические и требуют более широкого центрифугирования из-за высокой плотности и фильтрации и центрифугирования методы, которые могут привести к низкой активности из-за механических повреждений СН. Тем не менее, использование разрывных Перколла-сахарозы градиенты плотности, чтобы изолировать СН обеспечивает быстрый метод получения хороших урожаев трансляционно-активных СН. Перколла-градиенте сахарозы метод быстр и нежные, как она использует изотонический условиях, имеет все меньше и короче спины центрифугирования и избегает шагов, которые центрифугирования гранулы СН и вызвать механические повреждения.

Protocol

1. Подготовка ^1-4

1. Подготовка 500 мл градиент среды (GM) буфера путем смешивания 50 мл 2,5 М раствора сахарозы, 2,5 мл 1М Трис-HCl, pH7.5 акций, и 0,1 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0 акции с милли- Q водой до полного объема. Фильтры стерилизовать решение, аликвоты и хранить замороженные.
2. Подготовка 1000x запас тетродотоксин (TTX), сделав 1 мМ раствора в милли-Q H ₂ O. Аликвоты ТТХ могут храниться при температуре -20 ° C.
3. Подготовка 10x Буфер Стимуляция делая растворе 100 мМ трис (рН 7,5), 5 мМ Na ₂ HPO _{4, 4} мМ KH ₂ PO _4, 40 мМ NaHCO _3, и 800 мМ NaCl в милли-Q воды. Склада, может храниться при 4 ° C.
4. Предварительное охлаждение центрифуг до 4 ° C.
5. Подготовка исходного раствора Isosmotic Перколла (SIP), добавив 9 томов Перколла (18 мл) до 1 объемом 2,5 М сахарозы (2 мл) в милли-Q воды и хорошо перемешать.
6. Подготовка 3, 10, 15 и 23% слоев градиент путем добавления соответствующего количества SIP для GM буфера и смешивания каждого из них:

7. Залейте градиентом слоев с помощью пипетки 2 мл каждая из 23, 15, 10, 3% isosmotic решения Перколла в трубы центрифуги Beckman с колпачками использованием P1000 Gilson Pipetman. Интерфейс между слоями должны быть четко заметной без перемешивания слоев. Магазин градиентов при 4 ° С в течение по крайней мере 20 минут перед использованием. Градиенты могут храниться до 24 часов, хотя тот же день использования рекомендуется. [Неопытные сотрудники лаборатории могут практиковать подготовку градиенты, добавив синего красителя к isomotic решения Перколла для визуализации границ раздела слоев.]

2. Мышь рассечение ¹

1. Убедитесь, что все хозяйства мыши и эвтаназии процедуры выполняются в соответствии с НИЗ и Университета руководящих принципов. Эвтаназии щенков (возраст P13 на P21) углекислым газом удушья или метод одобрил в животном протокола.
2. Pin мыши рассечение борту и брызг задней части шеи и головы с этанолом. Использование острыми ножницами прорезать спинного мозга в основании черепа, удалить кожу от верхней части черепа, разрезать череп с боков между теменной кости и кости межтеменной или между головного мозга и коры регионах. Затем вырежьте череп от основания к носу (вдоль сагиттальной шва), осторожно снимите мягкой теменной кости, потянув каждого полушария в сторону и снять кору с помощью шпателя. Вставьте шпатель в мозг выше мозжечка, а затем выкопайте коры и поместить его в ледяной буфера GM. Немедленно приступить к гомогенизации шаг. Не позволяйте коры сидеть в ледяной буфера очень долго, так как это отрицательно влияет на формирование СН.

3. Подготовка гомогената и СН ^1-4

1. Промыть коры в ледяной буфера GM и передача два коры на стакан Dounce гомогенизатор, содержащий 5 мл холодного буфера GM.
2. Аккуратно гомогенизированный коры с 5-10 ударов свободные пестика (пестик ""), а затем на 5-10 ударов плотно пестиком (пестик "B"). Удары должны быть быстрыми, но достаточно медленно, чтобы не наносить воздушные пузыри. Картина гомогената после гомогенизации в схеме 1. Количество ударов будет варьироваться в зависимости от индивидуальных гомогенизатор и сопровождающих пестики. По окончании градиенты должны дать сильную полосу С.Н., если нет, регулировать количество ударов.
3. Передача гомогената на 15 мл конические и центрифуге при 1000xg в течение 10 мин при 4 ° С в роторе размахивая ведром (Allegra 6KR центрифуги) в гранулах распада клеток и ядер. Изображение выделяемых гомогенат на схеме 1.
4. Layer 2 мл супернатанта в Перколла-градиенте сахарозы, крышка трубы, и центрифуге при 32500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С фиксированным углом ротора (Beckman J2-21 центрифуг, JA-17 ротор) с помощью соответствующих адаптеров ( Смотрите Реактивы и оборудование таблицу).
5. Внесите выходные и отбросить решение выше группы С. Н. использованием стеклянной пипетки Пастера. Внесите от группы С. Н. на 15/23% интерфейсом, перевод на конической и хранить на льду. Каждый градиент или один коры будет производить 0,9-1,1 мл SN.
6. Отрегулируйте концентрации солей СН, добавив одну десятую объема буфера 10x стимуляции, добавить 1000x CaCl ₂ до конечной концентрации 12 нМ, и добавьте 1 мМ ТТХ акции конечной концентрации 1 мкМ для подавления неспецифической возбуждения. (Добавление CaCl ₂ не является обязательным, если он будет мешать течению приложений SN).
7. Определение концентрации белка СН использованием белка Micro BCA Пробирной Kit. (Анализ Брэдфорд белок не рекомендуется из-за вывода из Перколла.)
8. СН может быть использован непосредственно и быстро для белка трансляцииТион исследований. Для других приложений SN лизат может быть очищен или концентрированный использованием Пирс SDS-PAGE Пример Prep Kit.

4. Представитель результаты:

Когда мышь коры гомогенизировали и разделены на разрывной Перколла-сахарозы градиенты (Схема 1), 6 полос или фракции видели (рис. 1). Ранее было показано, для коры головного мозга крыс ^3,5, что компоненты с высоким молекулярным весом полосы были сломаны мембраны и миелин и гранулированный материал, содержащийся или органеллы митохондрии (табл. 1). 23% / 15% интерфейс (группа 5), содержащиеся обогащенного СН.

Полоса 23% / 15% интерфейса, содержащего нетронутыми СН, был снят и исследовали с помощью электронной микроскопии (ЭМ), как описано выше. ^2,6 EM показали наличие интактных синаптических пузырьков и сохранение пресинаптических и постсинаптических элементов (рис. 2). Выделение пре-и постсинаптического отсеков имеет важное значение для изучения сигнализации и синтез белка, который происходит в обоих отсеках. ^7-13 Перколла-сахарозы градиент сырой очистки, чтобы мы увидели незначительных клеточном, ядерной и органелл загрязнения во фракции, но С. Н. общее разделение было хорошо.

Когда рассматривается пятно Западной, Перколла фракций, содержащихся ожидается маркеров белков с увеличением синаптических чистоты в группе С. Н. (рис. 3, таблица 2). Synaptic и нейронных маркеров были сохранены в группе обогащенного SN (группа 5), но обилие других маркеров была значительно уменьшена. В частности, наличие GFAP, маркером астроцитов и опухолевые клетки глии происхождения, а Ламин-B1, ядерных маркеров, были незначительны, в то время структурные и синаптических маркеров были сохранены и усилены. Кроме того, было сохранение маркеров для органелл, таких, как митохондрии и Гольджи, которые играют роль в синтезе белка.

Типичные дает для группы С. Н. были 250-500 нг белка на мкл, как это определено анализа белка ДСС. Деятельность СН определяли количество де синтез белка заново представить как контролируется [35С]-Met регистрации (рис. 4). ² Базальные переводческой деятельности был увеличен 1,56 раз, когда СН были стимулированы с 50 мкМ glutamate/10 мкМ глицин (Glu), или 5,12 раза при активации с юглон ингибитор Pin1. Pin1 торможение, как известно, приводит к увеличению синтеза белка. ² Чтобы подтвердить, что увеличение [35С]-Met включение было связано с де-синтез белка заново, мы добавили 40 мкМ anisomycin, ингибиторов синтеза белка, и увидел заметное снижение включения в присутствии и отсутствии Glu по сравнению с базальной уровнях. Кроме того, при добавлении 2% Triton-X 100, что нарушает целостность СН, базальных перевод был снижен на 75%. ² Кроме того, при рассмотрении полос (В4-В6), которые показали самые синаптические маркер обогащения, СН или группы 5, наибольшую активность для вновь синтез белка (рис. 5). Таким образом, разрывные Перколла-сахарозы градиенты быстро создавать высокую активность и обогатил С. Н. группа, которая может быть использована для изучения трансляции белка.

Разрывных Перколла-градиенте сахарозы процедура является более выгодным, чем другие методы, поскольку механические повреждения вызвано более жесткими условиями. По сравнению с методом фильтрации, в котором очищается корковых гомогената пропускается через серию фильтров, которые уменьшаются в размерах, ^3,14-15 Перколла метод формы более СН с большей активностью. Как видно на рисунке 6, когда аликвоту СН подготовленный метод фильтрации был передан Перколла-градиенте сахарозы Существуют гораздо менее СН на 15/23%, а интерфейс большее количество сломанной мембран. Когда заново синтез белка была измерена с помощью S35-мет регистрации, СН подготовленный метод фильтрации были гораздо менее активны (рис. 7). Чтобы максимально переводческой деятельности мы используем мышей, которые в возрасте между P14 и P18. С. Н. могут быть получены из взрослых мышей, но мы наблюдали значительно увеличили переводческой деятельностью с С. Н. приготовленный из несовершеннолетних мышей (рис. 8).

Таблица 1. Составляющие группы из разрывных Перколла градиента фракционирования гомогенизированных коры мыши. ^3,5

Таблица 2. Резюме Западной анализ разрывных болтов Перколла-сахарозы трехсторонние градиент группы. Относительная концентрация белка для каждой группы фракций выделяли с помощью разрывных Percolл-градиенте сахарозы были определены иммуноблоттинга. Нет белок присутствует (-), 0 ≥ 0.2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), или> 0,8 (+++) раза больше, чем белки присутствуют в супернатант (S, центрифугируют гомогенат коры), представитель п = 3.

Схема 1: Схема подготовки SN использовании разрывных Перколла-сахарозы градиента плотности коре мозга мышей были вскрыты, гомогенизировали и центрифугировали при низкой скорости, чтобы удалить без гомогенизированной ткани, клетки, целые органеллы, такие как ядра и оболочки.. Разрывным градиентом должна иметь четко определенные слои. Вставке показана картина пример слоев, которые были окрашенных синим только для иллюстрации того, чтобы визуализировать слои. Супернатант слой поверх разрывных Перколла-градиенте сахарозы и центрифугировали при средней скорости. Группа С. Н. затем извлекается из градиента и готов к использованию.

Рисунок 1. Гомогената фракционирования на разрывной Перколла-градиенте сахарозы. Мышь коры гомогенизировали и разделены на разрывной Перколла-градиенте сахарозы что приводит к 6 полос или фракции. Очищенной, активная СН (*) были обнаружены в группе 5.

Рисунок 2. С. Н. подготовку дают разнородных СН, которые сохраняют пресинаптических и постсинаптических элементов. Электронная микрофотография подготовки SN приготовленный из C57BL / 6 мышей (возраст P13 на P21) проводили, как описано выше и показывает СН с сохраненной пресинаптические и постсинаптические элементы ^{2. , 6} Красная точка стрелки постсинаптической плотности. Шкала бар 1 мкм.

Рисунок 3. Западные анализы пятно препаратов С. Н. показал, что синаптические и нейронных маркеры сохраняются в очищенной СН (Band 5), но обилие других маркеров была значительно уменьшена. Иммуноблотов супернатанта (S, центрифугируют гомогенат коры) и Группы 1-6 из разрывных Перколла-градиенте сахарозы были исследованы для β-актина (структурные, загрузка контроль), GFAP (астроцитов), GP73 (Гольджи), HSC70 (цитоплазматических и ядерных) Ламин-B1 (ядерной), Prohibitin (митохондриальных), PSD95 (постсинаптической плотности ), SNAP25 (синаптической), Synaptophysin (синаптической) и β3-тубулина (нейрон-специфической). Полосы были визуализированы использованием Буря 860 Phosphorimager, представитель п = 3.

Рисунок 4. СН активны и обладают заново синтез белка через [35С]-Met регистрации. СН были заранее доведены до 37 ° С в течение 10 мин. Затем СН были неочищенных или предварительно в течение 15 мин с 40 anisomycin мкМ или 1 мкМ юглон при 37 ° С с последующим добавлением [35С]-Met, 20 мкл Express Pro Этикетка Mix S35 Легкая тегов, плюс-минус Glu при 37 ° С в течение 30 мин. Образцы были приготовлены с использованием Пирс SDS-PAGE Пример Подготовка комплекта, работает на 15% полиакриламидном геле, высушивают и количественно использованием молекулярной динамики Буря 860 phosphorimager, представитель п = 3, ± SEM.

Рисунок 5. Группа 5 из разрывных Перколла-градиенте сахарозы, содержащейся высокий уровень де синтез белка заново. Группы 4, 5 и 6, а супернатант (S, центрифугировали корковых гомогената) были заранее доведены до 37 ° С в течение 10 мин. Тогда, [35S]-Met, Express Pro Этикетка Mix S35 Легкая Tag, был добавлен, плюс-минус Glu при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Образцы были приготовлены с использованием Пирс SDS-PAGE Пример Подготовка комплекта, работает на 15% полиакриламидном геле, высушивают и количественно использованием молекулярной динамики Буря 860 phosphorimager, представитель п = 3, ± SEM.

Рисунок 6. СН приготовленный из метод фильтрации содержат больше сломанной мембран и менее чем в целом СН СН приготовленный из разрывных Перколла-сахарозы градиентным методом. СН были подготовлены, передавая гомогенизированный коры через серию фильтров с уменьшением размера пор, как описано выше. ^3,14-15 аликвоту СН подготовленный метод фильтрации центрифугировали над разрывным Перколла-градиенте сахарозы и по сравнению с эквивалентным количеством материала с помощью разрывных Перколла-сахарозы градиентным методом.

Рисунок 7. СН приготовленный из метод фильтрации содержат меньше заново синтез белка активность, чем СН подготовлены сюдам разрывных Перколла-сахарозы градиентным методом. СН были подготовлены, передавая гомогенизированный коры через серию фильтров с уменьшением размера пор, как описано выше, ^3,14-15 и разрывных Перколла-сахарозы градиентные методы. СН от обоих препаратов, предварительно уравновешенной до 37 ° С в течение 10 мин. Тогда, [35S]-Met, Express Pro Этикетка Mix S35 Легкая Tag, был добавлен, плюс-минус Glu при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Образцы были приготовлены с использованием Пирс SDS-PAGE Пример Подготовка комплекта, работает на 15% полиакриламидном геле, высушивают и количественно использованием молекулярной динамики Буря 860 phosphorimager, представитель п = 3, ± SEM.

Рисунок 8. СН от молодых мышей (P14) обладают большей активностью, чем поступательного старых мышей (P85). СН были получены из различных старых мышей использовании разрывных Перколла-сахарозы градиентный метод, preequilibrated при температуре 37 ° С в течение 10 мин, обработанных и необработанных с Glu в Наличие [35С]-Met (Express Pro Этикетка Mix S35 Легкая тегов) в течение 30 мин, оснастки заморожены, а затем очищается с Пирсом SDS-PAGE Kit Подготовка проб. СН были выполняться на 12% SDS-полиакриламидном геле, высушивают и отображается на молекулярной динамики Буря 860 phosphorimager, представитель п = 3, ± SEM. СН от P14 мышей, по крайней мере в 3 раза более активен, чем P85 мышей.

Discussion

Разрывных Перколла-градиенте сахарозы подготовки описаны в настоящем документе, быстрый, надежный способ, чтобы изолировать активных СН, который может быть использован в разнообразных экспериментах синаптической передачи. Этот градиент метод, который основан на методике, разработанной Данкли и соавт., ^3,4 является субклеточных процедуре фракционирования мозга, которая изолирует как до, так и постсинаптические мембраны полученных пузырьков, которые связаны друг с другом. Без дальнейшей очистки этих СН совмести...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Micro BCA белка Пробирной Kit	Проколоть	23235
CaCl 2	Рыболов	C79-500
СО 2	Airgas (UW-MDS)	CD 50
ЭДТА	RPI	E57020
EtOH	Рыболов	A407SK-4
HCl	Рыболов	A142-212
Перколла	GE Healthcare	17-0891-01
KH 2 PO 4	Рыболов	P285-500
PierceSDS-PAGE Пример Prep Kit	Проколоть	89888
NaCl	RPI	S23020
NaHCO 3	Рыболов	BP328-500
Na 2 PHO 4	Рыболов	S381-500
Сахароза	RPI	S24060
Трис базы	RPI	T60040
Тетродотоксин	Сигма	T5651
Express Pro Этикетка Mix S35 Легкая тегов	Перкин Элмер	NEG772
Оборудование	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Dissection инструменты
Dounce гомогенизатор, 7 мл (поставляется с двумя стеклянными пестики с надписью "А" и "B")	Уитон
P1000 Gilson Pipetman	Gilson	F123602
Аллегра 6KR Центрифуга	Beckman Coulter	366830
GH 3,8 Ротор, Бакет ротор	Beckman Coulter	360581
Beckman J2-21 Центрифуга	Бекман
Бекман труб с колпаками	Бекман	355672
Белые стены адаптеры	Бекман	342327
Синие стены адаптеры	Бекман
JA-17 Ротор с фиксированным углом ротора	Бекман	369691

Название антител	Компания	Номер в каталоге	Хост видов	Коэффициент разбавления
β-актин	Сигма	A5441	мышь	1:2000
GFAP	Санта-Крус	SC-65343	мышь	1:200
GP73	Санта-Крус	Sc-134509	кролик	1:200
HSC70	Санта-Крус	SC-7298	мышь	1:200
Laminβ	Санта-Крус	Sc-6261	козел	1:200
Prohibitin	Санта-Крус	SC-28259	кролик	1:200
PSD95	Millipore	MAB1596	мышь	5 мкг / мкл
SNAP25	AbCam	ab5666-100	кролик	1:2000
Synaptophysin	Millipore	MAB368	мышь	1:500
β-3-тубулина	Санта-Крус	SC-80016	мышь	1:200