Визуализация внутриклеточного транспорта груза в культивируемых астроцитах

Аннотация

Источник: Creighton, B. A., et al. Визуализация и анализ внутриклеточного транспорта органелл и других грузов в астроцитах. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео демонстрируется визуализация внутриклеточного транспорта грузов в культивируемых астроцитах с помощью флуоресцентного ацидотропного зонда, который селективно мечет кислые эндолизосомальные везикулы. Покадровая визуализация и получение Z-стека с помощью конфокального микроскопа позволяют отслеживать флуоресцентно помеченный груз по всему объему трехмерной клетки. Анализ отличает неподвижный груз от груза, движущегося к периферии клетки или ядру, что дает представление о динамике внутриклеточного транспорта.

Протокол

1. Трансфекция флуоресцентно меченых плазмид

1. За сутки до трансфекции или мечения посев астроцитов с желаемой плотностью для визуализации через 24−48 ч после трансфекции. Рекомендуемая плотность для 24-луночных планшетов или 14-миллиметровых лунок со стеклянным дном составляет 2 x 104 клетки/лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для трансфекции астроцитов, покрытых на стеклянных покровных стеклах 12 мм, на 24-луночных планшетах или 14-миллиметровых лунках со стеклянным дном с использованием метода, основанного на липофекции. Реактивы следует масштабировать в зависимости от размера чашки для культуры, в которой растут астроциты.
2. Разведите реагент для липофекции (Таблица материалов) в средах с пониженным содержанием сыворотки (Таблица материалов). Чтобы оптимизировать соотношение реагента для липофектиона и ДНК, протестируйте ряд адекватных разведений. Например, при использовании реагента, используемого в настоящем протоколе (Таблица материалов), разведите 2, 3, 4 и 5 мкл реагента для липофекции в 50 мкл среды с пониженным содержанием сыворотки.
3. Разбавьте 5 г ДНК высокой чистоты в 250 μл среды с пониженным содержанием сыворотки. Добавьте 5 мкл реагента-усилителя липофекции (Таблица материалов). Соедините пробирку, содержащую реагент для липофектиона, с равным объемом смеси усилителя ДНК и липофектиона. Перемешать с помощью пипетки и инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут.
4. Удалите питательные среды астроцитов и добавьте трансфекционную смесь (шаг 1.3) в клетки по каплям. После 6-часовой инкубации при 37 °C и 5% CO2 замените трансфекционный комплекс соответствующим объемом питательных сред для астроцитов (2 мл для посуды со стеклянным дном 14 мм). Инкубируйте еще 24−72 ч, прежде чем приступить к получению изображений. Внимательно следите за продолжительностью этапа инкубации для достижения наилучшего баланса между экспрессией белка и жизнеспособностью клеток.

2. Мечение поздних эндосом/лизосом с помощью флуоресцентных зондов

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые грузы могут быть мечены флуоресцентными красителями с высоким сродством к каргоспецифическим белкам. Следующий пример позволяет мечить поздние эндосомы/лизосомы с помощью флуоресцентного ацидотропного зонда.

1. Разведите зонд лизосомного мечения (Таблица материалов) в 200 мкл питательной среды астроцитов до рабочей концентрации 1 мкМ и нанесите на астроциты с этапа 1.1 при плотности 2 х 104 клеток/лунку. Выдерживать в течение 30 минут при температуре 37 °C.
2. Промойте клетки один раз теплой средой для культивирования астроцитов и замените средой для визуализации (Таблица материалов). Немедленно приступайте к съемке в реальном времени.

3. Получение изображений с помощью системы покадровой съемки

ПРИМЕЧАНИЕ: Покадровая съемка в реальном времени должна быть выполнена с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой, определенным фокусом, инкубационной камерой и 40-кратным масляным объективом с высокой числовой апертурой (например, Plan-Apochromat 1.4NA). Для покадровой съемки доступно различное программное обеспечение для сбора данных. Выбор системы микроскопии и программного обеспечения для сбора данных должен основываться на их доступности и пригодности для целей конкретного исследования. Некоторые общие рекомендации приведены ниже.

1. Поместите камеру или чашку для культивирования в соответствующий адаптер на предметном столике микроскопа. Используя эпифлуоресцентный свет, выберите клетку (клетки), которые экспрессируют флуоресцентные белки, или зонд для записи. Отрегулируйте освещение флуоресцентного образца для визуализации выбранных ячеек с помощью цифровой камеры. Избегайте использования источников интенсивного освещения, которые могут привести к фотообесцвечиванию и фототоксичности. Отрегулируйте фокус и зум.
2. Получайте одиночные серии покадровых съемок Z-стека с частотой 1 кадр каждые 2 с для интервалов времени от 300 до 500 с с помощью функций зума и определенной фокусировки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Динамика перемещения (скорость, частота движения и т. д.) будет варьироваться в зависимости от интересующего белка, поэтому временной ход сбора данных может потребовать корректировки. Например, митохондрии менее подвижны, чем лизосомы, и демонстрируют частые паузы. В этом случае более целесообразно настроить параметры сбора данных на 1 кадр каждые 5 с в течение 800 с.
3. Сохраняйте покадровые изображения и экспортируйте их в виде файлов AVI или TIFF.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Фетальная бычья сыворотка	Gemini	100-106	Термо-инактивированная
ФИДЖИ (Фиджи - это просто изображение J)	NIH	Версия 1.52i
Пинцет с тонким наконечником	F.S.T	11254-20	Стиль #5
Источник флуоресцентного света	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
Тарелка со стеклянным дном	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	Тарелка 35 мм | No 1.5 Покровное покрытие | Диаметр стекла 14 мм |
Щипцы Graefe	без покрытия F.S.T	11054-10	Щипцы Graefe Iris с изогнутыми кончиками
Зеленый флуоресцентный краситель, который окрашивает кислотные компартменты (поздние эндосомы и лизосомы)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. Предварительно растворен в ДМСО до 1 мМ стокового раствора. Разбавьте до конечной рабочей концентрации в питательной среде или буфере по выбору.
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (10x)	Gibco	14065-056	Магний и кальций без магния и кальция
Носители визуализации	Life Technologies	A14291DJ	Решение для визуализации живых клеток
Инвертированный конфокальный микроскоп	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Реагент	Life Technologies	11514015	Plus Реагент
Lipofection Реагент	Life Technologies	15338100	реагент Lipofectamine LTX
Орбитальный встряхивающий инкубатор	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , орбитальный встряхивающий инкубатор с контролем температуры и скорости
Раствор пенициллина/стрепомицина (100x)	Gen Clone	25-512
Фосфатный буферный раствор (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-лизина гидробромид	Sigma	P7405	Растворить в трис-буфере, pH 8,5, при 1 мг/мл. Заморозьте для длительного хранения. Избегайте циклов замораживания и размораживания
Пониженная сывороточная среда	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Колбы для культуры тканей	Olympus Plastics	25-209	75 см^2. 100% доступ под углом горлышка, 0,22 мкм гидрофобная вентилируемая крышка фильтра
Инкубатор для тканевых культур	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, инкубатор для тканевых культур с контролем
температуры, влажности и CO2Tris-Base	Sigma	T1503	8,402 г растворить до одного литра в воде с 4,829 г Tris HCl для получения 0,1 М Трис буфера, pH 8,5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4,829 г растворить на одном литре в воде с 8,402 г Tris Base для получения 0,1 М Трис буфера, pH 8,5