Трехмерная конфокальная визуализация гематоэнцефалического барьера в срезе мозга мыши с высоким разрешением

Аннотация

Источник: Villaseñor, R and Collin. L. Конфокальная визуализация гематоэнцефалического барьера с высоким разрешением: визуализация, 3D-реконструкция и количественная оценка трансцитоза. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео демонстрируется 3D-визуализация гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) с высоким разрешением с использованием конфокальной микроскопии, показывающая окрашенные антителами участки мозга мыши для анализа компонентов ГЭБ и внутриклеточных структур, применимых для изучения гомеостаза мозга, нейроваскулярных взаимодействий и дисфункции ГЭБ, связанной с заболеванием.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Конфокальная визуализация гематоэнцефалического барьера с высоким разрешением
2. Получение изображений с помощью подходящего лазерного сканирующего конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов) с лазерными линиями на длине волны 405, 488, 561 и 633 нм для возбуждения флуорофоров в синей, зеленой, оранжевой и красной областях светового спектра. Для получения изображения используйте масляный объектив с 63-кратным увеличением и числовой апертурой 1,4.
3. В меню сбора данных программного обеспечения, управляющего микроскопом, задайте параметры получения изображения. В выпадающем меню «Размер изображения» выберите значение 1024 x 1024 пикселей. Измените размер пикселя до значения от 200 до 300 нм, отрегулировав значение меню "Масштаб"."
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа внутриклеточных структур уменьшите размер пикселя до 75 нм. Этот параметр размера изображения значительно увеличивает время съемки и может быть уменьшен до 512 x 512 пикселей для уменьшения времени съемки за счет отображения меньшего поля зрения.
4. В выпадающем меню «Скорость захвата» выберите значение 400 Гц, т.е. 400 строк в секунду. В меню «Системные настройки» выберите выпадающее меню «Глубина пикселя» и измените значение на 12 бит.
5. В программном обеспечении микроскопа на вкладке «Съемка» включите опцию последовательной съемки кадра. Установите толщину оптического сечения на значение от 0,75 до 1 мкм для каждого канала, изменив значение в меню «Pinhole».
6. На панели для флуоресцентного возбуждения активируйте лазер, необходимый для оптимального возбуждения флуорофоров в образце, например, лазерной линии с длиной волны 488 нм для флуорофора, излучающего зеленый цвет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте просмотрщик спектров флуорофоров (см. Таблицу материалов) для выбора подходящего лазера возбуждения.
7. На панели для обнаружения флуоресцентных ламп переместите ползунок, чтобы выбрать длины волн, которые будут измеряться в каждом канале, например, от 510 до 550 нм для флуорофора, излучающего зеленый цвет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте средство просмотра спектров флуорофора (см. Таблицу материалов) для выбора подходящих длин волн обнаружения.
8. Добавьте каплю иммерсионного масла с показателем преломления 1,52 на верхнюю часть покровного стекла с мозговым участком, чтобы он соответствовал показателю преломления стеклянного покровного стекла и объектива. Поместите образец в микроскоп и включите эпифлуоресцентную лампу, чтобы визуализировать образец с помощью бинокля микроскопа.
9. С помощью кнопок на подставке для микроскопа измените колесо фильтров, чтобы выбрать фильтр, подходящий для визуализации ядер, окрашенных DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол). Используйте грубый фокус, чтобы сфокусировать сигнал от окрашенных DAPI ядер.
10. С помощью кнопок на подставке для микроскопа меняйте фильтры для визуализации сигнала от сосудистых маркеров (например, CollagenIV или CD31) и центрируйте поле зрения на отдельном капиллярном сегменте.
11. Нажмите кнопку, чтобы запустить режим сканирования в реальном времени. Во время сканирования отрегулируйте усиление и интенсивность лазера для каждого канала, чтобы максимизировать динамический диапазон изображений и избежать насыщения пикселей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте таблицу поиска, которая помечает насыщенные пиксели для визуальной оценки перенасыщения. Чтобы избежать перенасыщения сигнала, отрегулируйте настройки с помощью образца, который должен иметь самый высокий флуоресцентный сигнал.
12. Установите значение для усреднения линий на 2,
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании более высоких скоростей сбора данных увеличьте это значение, чтобы уменьшить шум.
13. Установите начальный и конечный участки для выполнения оптических z-стеков, охватывающих весь объем капилляра. Используйте размер шага 0,45 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если изображения будут использоваться для последующей количественной оценки, оставьте те же настройки сбора для всего набора данных.
14. Для количественной оценки соберите от 10 до 20 z-стеков на секцию по крайней мере от трех разных мышей для статистического сравнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите полный набор данных за один и тот же сеанс, чтобы уменьшить вариабельность, возникающую при обесцвечивании образцов и колебаниях интенсивности лазера.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клон моноклонального антитела крысы ER-MP12 против CD31/PECAM	Novus Biologicals	MCA2388	меток эндотелиальных клеток мозгаИспользование при разведении 1:100Обнаружение с помощью ослиного поликлонального антикрысиного IgG (H+L) в сочетании с подходящим красителем AlexaFluor, используемый при разведении 1:400
Моноклональное антитело крысы против подокаликсина	R&D системы	MAB1556	меток Просвет капилляровИспользование при разведении 1:100Обнаружение с помощью поликлонального антикрысиного антитела IgG (H+L) в сочетании с подходящим красителем AlexaFluor, используемое при разведении 1:400
Поликлональное антитело кролика против коллагенаIV	Biotrend	BT21-5014-70	Метки Базальная мембрана капилляровПрименение при разведении 1:100Детектировать с ослиным поликлональным антикроличьим IgG (H+L) в сочетании с подходящим красителем AlexaFluor, использовать при разведении 1:400
Козье поликлональное антитело против CD13	R&D Systems	AF2335	Метки перицитовИспользовать при разведении 1:100Детектировать с ослиным поликлональным антикозьим IgG (H+L) в сочетании с подходящим красителем AlexaFluor, использовать при разведении 1:400
Клон мышиного моноклонального антитела G-A-5 против GFAP в сочетании с Cy3	Abcam	ab49874	Метки АстроцитыИспользование при разведении 1:100
Кроличье поликлональное антитело против Iba-1	Wako	019-19741	Метки МикроглияИспользование при разведении 1:100Обнаружение с ослиным поликлональным антикрысовым IgG (H+L) в сочетании с подходящим красителем AlexaFluor, используемый при разведении 1:400
Крысиное моноклональное антитело ABL93 gainst LAMP2	Fitzgerald	10R-CD107BBMSP	Метки ЛизосомыИспользуйте при разведении 1:100Детектируйте с поликлональным антикрысиным IgG (H+L) в сочетании с подходящим красителем AlexaFluor, используемым при разведении 1:400
Поликлональное антитело осла против мышиного IgG (H+L) AlexaFluor594	LifeTechnologies	A21203	Использование при разведении 1:400
Поликлональное антитело осла против мышиного IgG (H+L) AlexaFluor488	LifeTechnologies	A21202	Использование при разведении 1:400
Козье поликлональное антитело против мыши IgG (H+L) AlexaFluor555	LifeTechnologies	A21422	Использование при разведении 1:400
Флуоресцентный монтажный носитель	Dako	S3023	Флуоресцентный монтажный материал Dako Лазерный
сканирующий конфокальный микроскоп	Leica Microsystems	NA	Leica TCS SP8 X с детекторами HyD и лазером белого света
Программное обеспечение для обработки изображений	Leica Microsystems	NA	Leica Application Suite AF версия 3.1.0 сборка 8587
Программное обеспечение для анализа изображений	Программное обеспечение для анализа битовых плоскостей	NA	Imaris версии 7.6.5 сборка 31770 для x64
Флуоресцентные спектрыViewer	ThermoFisher Scientific	NA	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html