$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Загрузочные элементы с перхлоратом этилового эфира тетраметилродамина (ТМРЭ)
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе ТМРЭ используется в негасящем режиме при конечной концентрации 20 нМ. В общем случае следует использовать минимально возможную концентрацию TMRE, которая при этом обеспечивает достаточную интенсивность сигнала на выбранном микроскопе. Из-за неравномерного испарения объем среды в разных лунках может отличаться в многолетних первичных культурах. Чтобы обеспечить постоянную концентрацию ТМРЭ во всех лунках, не добавляйте ТМРЭ непосредственно в лунки. Вместо этого замените среду в каждой лунке таким же количеством среды, содержащей TMRE. Приведенный ниже протокол предназначен для первичных нейронов в 24-луночных планшетах, содержащих ~1 мл среды на лунку.
- Работая в тканевом культуре ламинарного проточного колпака, соберите по 500 мкл среды из каждой лунки в одну коническую пробирку.
- В каждую лунку добавьте 0,5 мкл 20 мкМ материала TMRE в коническую пробирку (например, 12 мкл на 24 лунки).
- Осторожно отсадите оставшуюся среду из первой лунки и замените ее 500 мкл среды, содержащей TMRE. Продолжайте, шаг за шагом, с оставшимися лунками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы клетки не высохли и не потревожили их. - Верните клетки в инкубатор и подождите не менее 60 минут для уравновешивания красителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время загрузки может быть увеличено до нескольких часов без побочных эффектов. - Чтобы обеспечить постоянную концентрацию и равновесие TMRE на протяжении всего эксперимента по визуализации, обязательно включите концентрацию 20 нМ TMRE в буфер для визуализации и все растворы для стимуляции.
2. Оптимизация настроек сканирующего конфокального микроскопа
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг направлен на поиск наилучшего компромисса между качеством изображения и жизнеспособностью клеток во время визуализации в реальном времени. В этом разделе описывается оптимизация настроек визуализации зеленого флуоресцентного белка (roGFP), чувствительного к окислению. Если выполняется мультипараметрическая визуализация, аналогичная оптимизация, включая проверку стабильного базового уровня без признаков обесцвечивания или фототоксичности, должна быть выполнена для дополнительных показателей.
- Запустите конфокальный микроскоп и загрузите стандартные настройки для визуализации GFP (возбуждение 488 нм, излучение 505 - 550 нм).
- Установите детектор на 12 бит или 16 бит. заметка: Обычно 8 бит недостаточно для количественной визуализации.
- Активируйте режим последовательного сканирования и добавьте вторую последовательность/дорожку (возбуждение 405 нм, излучение 505 - 550 нм).
- Для обоих каналов выберите таблицу поиска псевдоцветов, которая указывает на переэкспонированные и недоэкспонированные пиксели (например, GLOW OU).
- Выберите объектив, подходящий для интересующего объекта.
ПРИМЕЧАНИЕ: 10-40x подходят для анализа одиночных клеток, 63x-100x подходят для анализа одиночных митохондрий. - Установите покровное стекло с ячейками в камеру визуализации, добавьте 1 мл буфера для визуализации и поместите камеру на микроскоп.
- Используйте окуляр и проходящий свет для фокусировки клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте эпифлуоресцентный свет для определения местоположения и фокусировки клеток. Даже при небольшой мощности это негативно скажется на клетках. - Записывайте изображения с различными форматами пикселей. Основываясь на этих изображениях, выберите наименьшее количество пикселей, которое дает приемлемое разрешение интересующей структуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 512 x 512 пикселей хорошо подходят для визуализации одной клетки с 20-кратным и 40-кратным объективом, а 1024 x 1024 или 2048 x 2048 пикселей обычно хорошо подходят для визуализации одиночных митохондрий с 63-кратным объективом. - Записывайте изображения с отверстиями разных размеров. Основываясь на этих изображениях, выберите самый большой размер отверстия, который дает приемлемое разрешение интересующей структуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, хорошо работают 3-7 воздушных блоков. - Записывайте изображения с различной интенсивностью лазера.
- Отрегулируйте усиление детектора и порог соответственно. На основе этих изображений выберите самую низкую интенсивность лазера, которая обеспечивает приемлемую интенсивность сигнала и соотношение сигнал/фон.
- Чтобы определить соотношение сигнал/фон, измерьте интенсивность сигнала в области интереса (ROI), которая содержит клетки или митохондрии (ROI1), и в ROI без клеток или митохондрий (ROI2). Затем разделите интенсивность ROI1 на интенсивность ROI2,
>ПРИМЕЧАНИЕ: Стремитесь к соотношению сигнал/фон >3 и интенсивности сигнала отдельных ROI 200-1000 для возбуждения 405 нм при 1-3% мощности лазера и интенсивности отдельных ROI 300-1500 для возбуждения 488 нм при 1% мощности лазера.
- Записывайте изображения с разной скоростью сканирования и количеством средних кадров. Записывайте 4-5 изображений для каждой комбинации настроек. Основываясь на этих сериях изображений, выберите самую высокую скорость и самые низкие средние настройки, которые обеспечивают приемлемый шум изображения и вариативность от изображения к изображению.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость сканирования 600 Гц и 1-2 кадра для усреднения хорошо работают в большинстве случаев. - Используя новую обложку, запишите серию интервальной съемки с оптимизированными настройками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность и интервал изображения серии должны быть аналогичны запланированным экспериментам. - В конце серии интервальной съемки добавьте в записывающую камеру 1 мл раствора 2x Diamide (DA). Изображение еще на 2 мин.
- Аспирируйте буфер для визуализации с помощью перистальтического насоса или ручной пипетки. Добавьте 1 мл 1х раствора дитиотреитола (DTT). Изображение еще на 5 мин.
- Проанализируйте эксперимент с интервальной съемкой.
- Убедитесь, что ни один из двух каналов не подвергается чрезмерной или недостаточной воздействию во время DA- и DTT-обработки с оптимизированными настройками.
- Убедитесь, что ни один из двух каналов не показывает значительного обесцвечивания во время цейтраферной записи; стремитесь к потере интенсивности на <2% между первым и последним изображениями.
- Убедитесь, что соотношение 405:488 существенно не изменяется во время визуализации.
- Повторяйте всю процедуру итеративным образом, используя несколько покровных накладок, пока не будут определены параметры, которые постоянно обеспечивают приемлемые результаты.
3. Оценка базального окислительно-восстановительного состояния
- Запустите микроскоп и загрузите оптимизированные настройки из раздела 2.
- Установите среднее значение кадра на 3-5.
- Установите покровное стекло с ячейками в камеру визуализации, добавьте 1 мл буфера для визуализации и поместите камеру на микроскоп.
- Используйте окуляр и проходящий свет для фокусировки клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте эпифлуоресцентный свет для определения местоположения и фокусировки клеток. Даже при небольшой мощности это негативно скажется на клетках. - Переключитесь в режим сканирования и используйте канал 488 нм в режиме live view для фокусировки и определения местоположения ячеек для визуализации.
- Используйте функцию многоточечной связи для выбора 3-5 полей обзора на обложке.
- Запишите базовое изображение.
- Добавьте в камеру 1 мл 2x раствора DA.
- Через 1, 2 и 3 минуты используйте режим live view для подтверждения/корректировки фокусировки, а затем запишите изображение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки обычно полностью окисляются через 2 минуты. - Замените буфер в камере визуализации 1 мл 1x раствора DTT.
- Через 3 и 5 минут используйте live view для подтверждения/корректировки фокусировки, а затем запишите изображение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки обычно полностью уменьшаются через 4-5 минут.
4. Живая визуализация острых методов лечения
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол описывает визуализацию окислительно-восстановительного ответа митохондрий на лечение NMDA. Интервалы между изображениями и продолжительность эксперимента могут потребоваться для коррекции для других видов лечения.
- Запустите микроскоп и загрузите оптимизированные настройки из раздела 3.
- Установите интервал интервальной съемки на 30 с и продолжительность на 25 минут.
- Установите покровное стекло с клетками в камеру для визуализации, добавьте 1 мл буфера для визуализации и поместите камеру на микроскоп.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать дрейфа теплового фокуса, оставьте клетки на предметном столике микроскопа на 10-15 минут перед началом покадровой визуализации. - Используйте окуляр и проходящий свет для фокусировки клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте эпифлуоресцентный свет для определения местоположения и фокусировки клеток. Даже при небольшой мощности это негативно скажется на клетках. - Переключитесь в режим сканирования и используйте канал 488 нм в режиме live view для фокусировки и определения местоположения ячеек для визуализации.
- Дополнительно: Чтобы увеличить количество записываемых ячеек за прогон, используйте функцию мультиточки для отображения 2-3 полей зрения на один покровный лист.
- Запустите цейтраферную съемку и запишите 5 изображений в качестве базовой записи продолжительностью 2 минуты.
- Добавьте в камеру 500 μL 3x NMDA раствора (конечная концентрация 30 μM) и запишите дополнительные 20 изображений в качестве 10-минутного NMDA-ответа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нейроны очень чувствительны к изменениям осмолярности. Поэтому убедитесь, что сведение к минимуму испарения буфера для визуализации. Для более длительных процедур камеру визуализации следует накрыть крышкой. - Добавьте в камеру 500 μл 4x DA раствора и запишите еще 6 изображений (максимальная калибровка 3 минуты).
- Отберите буфер из камеры визуализации и замените его 1 мл 1x раствора DTT. Запишите еще 10 изображений (минимальная калибровка 5 минут).
- Завершите запись и сохраните серию изображений.