Трехмерная визуализация иммуномеченых астроцитов с помощью конфокальной микроскопии

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Животные, хирургия и подготовка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте ткани мозга к трехмерному (3D) конфокальному микроскопическому анализу.

1. Случайным образом разделите животных на две группы: бета-амилоид (Aβ)_1-40\u2012 инъекции (n = 8) и Aβ_1-40\u2012 инъекции с лечением генистеином (n = 8); вводите генистеин (10 мг/кг, разведенный в средстве, таком как полиэтоксилированное касторовое масло) через зонд за 1 час до операции.
2. Обезболивайте животных кетамином (100 мг/кг) и ксилазином (10 мг/кг). Подтвердить правильную анестезию можно отсутствием рефлекса отмены после защемления пальца ноги. Используйте мазь для глаз во время операции, чтобы предотвратить сухость.
3. Поместите животных в стереотаксический аппарат и побрейте голову. Применяйте раствор йода для очистки кожи головы перед разрезом и сохраняйте стерильность места операции во время операции, чтобы снизить риск инфекции. Введите Aβ_1-40 стереотаксически (4 мкл) в гиппокамп на расстоянии −3,5 мм позади брегмы, ± на 2 мм латеральнее средней линии и на −2,8 мм ниже твердой мозговой оболочки, согласно атласу мозга крысы.
4. Обеспечьте послеоперационное наблюдение/уход до тех пор, пока животные не придут в полное сознание, чтобы обеспечить комфорт животных. Держите животных в тепле во время выздоровления, и не возвращайте их в клетку с другими животными до полного выздоровления. Обратите внимание на любые признаки инфекции у животных после хирургического вмешательства.
5. Глубоко обезболить животных кетамином (150 мг/кг) через три недели после операции. Выполните транскардиальную фиксацию путем перфузии животных 0,9% физиологического раствора с последующим добавлением 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатного буферного раствора или PBS (pH = 7,4), затем удалите и зафиксировайте мозг.
6. После фиксации мозга в 4% параформальдегиде в течение 2-3 дней при температуре 4 °C.
7. Поместите салфетку в парафиновые блоки с помощью оборудования для заделки тканей и избегайте недостаточного или чрезмерного заполнения кассеты, так как это может помешать правильному выравниванию или разделению. Обратите внимание на ориентацию тканей в парафиновом блоке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гиппокамп крысы, например, находится близко к задней части полушария головного мозга. Таким образом, ткань должна быть внедрена таким образом, чтобы разделение начиналось в задней части мозга. Используйте атлас Paxinos в качестве руководства для достижения желаемой анатомической структуры.
8. Размещайте микротом вдали от сквозняков или дверных проемов, так как движение воздуха затрудняет работу с секциями.
9. Используйте срезы толщиной ≥20 мкм, так как эта глубина будет необходима для получения Z-Stack изображений полных астроцитов. Не используйте первые пару секций, так как они могут иметь нежелательную толщину из-за теплового расширения.
10. Поместите секции на поверхность теплой воды (5 ± 2 °C, ниже температуры плавления парафина) ровно настолько, чтобы сравнять секции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное расширение секции может нарушить морфологию конструкции. Используйте крошечную кисть, чтобы аккуратно перенести секции. Соберите по два-три секции на каждом слайде.
11. Храните предметные стекла в вертикальной решетке и дайте им высохнуть при температуре 37 °C в течение нескольких часов или в течение ночи (O/N).

2. Иммуногистохимия

1. Депарафинизируйте срезы в ксилоле 2 x 10 мин и регидратируйте через градиент алкоголя (99,8%, 95% и 70%, по 10 мин каждый) и PBS.
2. Инкубируют с антителами против глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), разведенного в соотношении 1:1500 в PBS, содержащем 0,25% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,25% Triton X-100 и 3,5% нормальной сыворотки (O/N при 4 °C).
3. Промыть секции в PBS в течение 3 х 5 мин.
4. Инкубировать со вторичными щелочными фосфат-конъюгированными антителами в течение 1 ч (1:100, 21°C, разведенные в PBS).
5. Промойте срезы в PBS в течение 3 x 5 мин.<бр />ПРИМЕЧАНИЕ: Важно правильно промывать срезы после вторичных антител, чтобы свести к минимуму фоновое окрашивание.
6. Инкубируйте срезы в темноте с жидким постоянным красным хромогеном (15-20 мин).
   Примечание: Готовьте раствор не более чем за 30 минут до использования.
7. Промыть секции в PBS в течение 3 х 5 мин.
8. Наконец, окрасьте ядра 4-6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; 1:500, разведенный в PBS) перед скольжением покрова. Храните предметные стекла в холодильнике в течение 24-48 часов до проведения микроскопии.

3. Конфокальная микроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественной оценки (см. ниже) выберите астроцит с четко видимым DAPI-окрашенным ядром с минимальным количеством перекрывающихся ветвей, чтобы снизить риск ошибок. Создание изображений Z-Stack занимает много времени. Наберитесь терпения и не останавливайтесь во время обработки. Вертикальный конфокальный лазерный сканирующий микроскоп используется для создания 3D-изображений астроцитов.

1. Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа и выберите объектив 63X.
2. Откройте программное обеспечение для работы с изображениями и нажмите «Пуск системы». Перейдите на вкладку «Найти». Перейдите в раздел «Назначить» и выберите GFP, чтобы настроить правильное освещение.
3. Откройте затвор, чтобы отразить свет. Найдите револьвер с револьвером с правой стороны от затвора и выберите цвет, который должен отражаться астроцитами (зеленый, красный или фиолетовый); Здесь был использован красный цвет (FSet20 wf).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте фокусировать изображение непосредственно в окуляре микроскопа.
4. Чтобы найти наилучший фокус, нажмите «Все закрыто», переведите булавку микроскопа в режим экрана и перейдите на вкладку «Захват».
5. Нажмите «Умная настройка» на вкладке «Приобретение», после чего откроется окно. Выберите подходящий флуорофор (т.е. DAPI и Alexa Fluor 555, в текущем проекте) из списка. Цвет выбирается автоматически.
6. Нажмите на кнопку «Лучший сигнал и применить», затем нажмите на кнопку «Установить экспозицию», после чего компьютер автоматически установит параметры экспозиции.
7. Для оптимизации изображения перейдите в окно «Каналы». Снимите отметку с Track2, выделите Track1 и нажмите на Live. При необходимости сосредоточьтесь на изображении.
8. В окне «Каналы» настройте следующие клавиши; нажмите на 1AU для автоматической оптимизации отверстия. Очень важно сделать этот шаг, иначе конфокальные изображения будут неоптимальными. Отрегулируйте усиление, чтобы получить наилучшую интенсивность (держите эту настройку ниже 800, чтобы уменьшить дополнительный шум). Наконец, установите цифровое усиление в диапазоне от 2 до 3.
9. Снимите отметку с Track1, нажмите на Track2 и повторите шаг 3.8 для Track2. Затем остановите Live.
10. Перейдите в окно «Режим сбора». Улучшите изображение, оптимизировав Размер кадра и Усреднение. Чтобы изменить размер рамки, перейдите в раздел X*Y и выберите 1,024 x 1,024. Выберите медленную Скорость, чтобы создать более качественное изображение.
11. Перейдите в раздел Усреднение и выберите число ≥4. Это усредненное значение указывает количество сканирований, которые будут усреднены для получения полученного изображения. Теперь нажмите на кнопку «Привязать» и сохраните захваченное 2D-изображение.
12. Для 3D-визуализации отметьте элемент Z-Stack в разделе «Умная настройка», чтобы окно Z-Stack открылось.
13. Установите первую и последнюю позиции для Z-Stack, т.е. глубину ячейки. Сначала нажмите «В прямом эфире». Затем с помощью фокусного привода микроскопа сфокусируйтесь на самом верхнем положении астроцита в ткани, где должен начинаться Z-Stack. Нажмите «Установить первым». Затем сфокусируйтесь на самом нижнем положении астроцита в ткани, где сканирование Z-Stack должно быть остановлено. Нажмите на кнопку «Установить последним». Затем остановите Live.
14. Выберите интервал; в текущем исследовании используется 1,01 мкм; выбор интервала можно сделать, нажав на кнопку Оптимальный, чтобы задать количество срезов.
15. Нажмите на кнопку «Начать эксперимент». Сохраните изображения после завершения сканирования. Это изображение будет использоваться для измерения следующих параметров: площадь поверхности и объем территории астроцита, а также всего астроцита, включая ветви, тело клетки и ядро.